《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Interpretable machine learning uncovers core seminal microbial signatures in idiopathic oligoasthenospermia
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背景：既往研究已证实精液微生物群的变化与男性少弱精子症（OA）密切相关。然而，当前研究仅定性描述微生物群落的差异，未能筛选出具有独立判别价值的核心标志物，也未能定量评估微生物群落的诊断效能，导致精液微生物群在少弱精子症中的诊断价值研究不足。方法：本研究共招募4
背景：既往研究已证实精液微生物群的变化与男性少弱精子症（OA）密切相关。然而，当前研究仅定性描述微生物群落的差异，未能筛选出具有独立判别价值的核心标志物，也未能定量评估微生物群落的诊断效能，导致精液微生物群在少弱精子症中的诊断价值研究不足。方法：本研究共招募40例未接受治疗的特发性少弱精子症（IOA）患者和30例生育力正常对照（FC）。采用16S rRNA测序技术对精液样本进行测序，评估微生物多样性和丰度的差异。随后，运用三种机器学习算法进一步识别核心微生物并评估其诊断性能。然后，采用SHapley Additive exPlanations（SHAP）分析方法解释这些核心微生物对疾病的贡献。此外，使用重建未观测状态群落系统发育调查2（PICRUSt2）算法预测核心微生物的功能。结果：精液微生物群落分析显示，IOA组与FC组之间精液微生物群的内部组成结构存在差异。机器学习算法共识别出5个核心细菌属。该模型的曲线下面积（AUC）为0.773，95%置信区间（CI）为0.661–0.885，表明该模型具有较强判别能力。SHAP分析进一步揭示了微生物丰度与疾病预测之间的关联方向。此外，KEGG通路预测显示，5个核心属主要富集于碳水化合物和核酸代谢通路，其中糖酵解/糖异生最为显著（P = 6.67 × 10-3）。结论：本研究采用多种机器学习算法对特发性少弱精子症患者精液微生物群进行了系统性特征研究。该方法克服了传统微生物群分析的局限性，构建了基于核心细菌属的风险预测模型，初步探索了精液微生物群作为IOA非侵入性筛查候选标志物的潜力，为后续非侵入性诊断标志物及机制研究提供了参考，也为该疾病的非侵入性精准诊断和微生物组致病机制分析提供了基础。
特发性少弱精子症（idiopathic oligoasthenospermia, IOA）是临床常见的男性不育类型之一，患者仅表现为精子浓度降低和精子活力下降，且无明确生殖系统器质性病变、内分泌紊乱或已知致病微生物感染。目前该病缺乏特异性诊断指标和精准干预手段，治疗策略单一，整体疗效有限。既往研究已证实生殖道微生态稳定与男性生殖功能密切相关，精液中定植着结构稳定的共生微生物群落，维持局部微环境稳态并参与精子发生和成熟调控。一旦微生物群落失衡，有害菌异常增殖、有益菌丰度下降，可诱发局部慢性炎症、氧化应激紊乱和精子能量代谢障碍，最终导致精液质量下降。然而，现有研究多采用传统差异分析方法，虽初步确认了微生物失调与少弱精子症的关联，但难以从高维数据中精准筛选核心微生物，无法量化微生物的贡献权重、阐明其作用方向和丰度依赖规律，从而限制了临床参考价值。可解释机器学习方法近年逐渐应用于微生物组研究，为解决上述不足提供了新工具。该研究基于16S rRNA测序分析IOA患者精液微生物结构，采用可解释机器学习模型筛选核心微生物，并结合SHAP分析和功能预测，旨在鉴定稳定的微生物标志物并阐明其在少弱精子症发生发展中的潜在机制。
研究人员从2024年7月至2025年3月招募了40例IOA患者和30例生育力正常对照（FC），采集精液样本进行16S rRNA V3-V4区测序。质量控制方面，研究随机化样本处理顺序，排除常见实验室污染菌属，仅纳入DNA浓度≥1.0 ng/μL的样本建库。研究人员采用Wilcoxon检验筛选差异菌属作为特征变量，并进行中心对数比（CLR）变换以消除微生物组数据的成分效应。随后并行使用最小绝对收缩和选择算子（LASSO）回归、随机森林（RF）、支持向量机-递归特征消除（SVM-RFE）三种机器学习算法筛选特征，取三者交集确定核心菌属。为防止信息泄漏，采用嵌套、重复、分层交叉验证框架（5折×20次重复），预处理和特征选择仅在训练集内进行。最终分类器为Firth惩罚逻辑回归。使用fastshap包（nsim=100）计算SHAP值，量化每个菌属对疾病分类的贡献方向和作用方向。功能预测采用PICRUSt2算法将核心菌属对应ASV序列映射至KEGG通路，并通过独立样本t检验比较组间差异。
研究结果如下。
临床基线信息：IOA组与FC组在年龄和体重指数（BMI）方面无显著差异（P > 0.05），而精子活力率（SMR）、前向运动精子比例（PR）、精子浓度（SC）和总精子数（TSC）在两组间差异均有统计学意义（P < 0.001）。
精液微生物群落状态类型与多样性：通过DADA2去噪获得11,535个ASV。IOA组有6,296个独有ASV，FC组有4,593个独有ASV，两组共享646个ASV。稀释曲线和Good's Coverage曲线表明测序深度充分、结果可靠。门水平上，拟杆菌门（Bacteroidota）和厚壁菌门（Firmicutes）为优势菌门，合计占比超过85%；IOA组Bacteroidota比例下降，Firmicutes比例升高。属水平上，Muribaculaceae、Lachnospiraceae_NK4A136_group、乳杆菌属（Lactobacillus）和拟杆菌属（Bacteroides）为优势核心属。值得注意的是，普雷沃菌属（Prevotella）在IOA组显著升高，而Bacteroides降低。α多样性分析显示Chao1指数和Shannon指数在两组间无显著差异，表明物种丰富度和整体多样性相当。基于Binary-Jaccard距离的主坐标分析（PCoA）显示两组微生物群落呈现明显分离趋势，PERMANOVA检验证实组间结构差异显著（F = 1.08, R2=0.016, P = 0.0160），PERMDISP检验显示组间多变量离散度无显著差异（F = 0.0027, P = 0.963），确认分离源于群落质心移位而非组内方差差异。
IOA核心微生物标志物筛选与诊断模型构建：Wilcoxon秩和检验共鉴定出24个显著差异菌属。RF算法筛出前15个候选菌属，LASSO回归选出6个核心菌属，SVM-RFE识别出9个重要菌属。三种算法取交集后获得5个稳健的核心微生物属，即Blautia、Prevotella、Bacteroides、Nesterenkonia和[Eubacterium]_oxidoreducens_group。基于这些核心特征构建的诊断模型受试者工作特征（ROC）曲线显示AUC为0.773（95% CI: 0.661–0.885），校准曲线表明模型具有良好的校准能力。SHAP分析显示，Blautia对模型预测贡献最大（平均|SHAP| = 0.132），且主要呈负向效应，高丰度样本对应负SHAP值，提示其可能是保护性菌群；Prevotella呈稳定正向效应，丰度越高SHAP值越趋正，提示其富集增加IOA风险；Bacteroides呈现双向效应，低丰度样本多为正SHAP值，高丰度样本多为负SHAP值；Nesterenkonia和[Eubacterium]_oxidoreducens_group整体以正向效应为主，丰度增加倾向于提高IOA预测概率。
与IOA相关的代谢通路：KEGG功能预测显示，IOA组精液微生物群在遗传信息处理相关初级通路中显著富集（P = 1.6×10
-2），其下属的6个次级功能模块（核苷酸代谢、翻译、复制与修复、转录、蛋白质加工和膜运输）均显著富集（P < 0.05）。三级通路中，糖酵解/糖异生、嘌呤代谢、嘧啶代谢、核糖体、氨酰-tRNA生物合成以及氨基糖和核苷酸糖代谢是主要差异富集通路，其中糖酵解/糖异生富集最为显著（P = 6.67×10
-3），表明IOA患者精液微生物群在碳水化合物代谢、核酸代谢和遗传信息处理方面存在预测功能偏移。
讨论部分，研究人员认为精液微生物失衡并非表现为物种的大量丧失或增加，而是内部结构、优势类群和相对丰度的重塑。根据SHAP结果和文献证据提出工作假说：Blautia作为短链脂肪酸产生菌，可能通过抑制氧化应激和NLRP3炎症小体激活、减少活性氧积累来保护精子；Bacteroides可降解多糖产生短链脂肪酸，为精子线粒体提供能量底物并调节睾酮分泌，其双向效应可能与丰度依赖的生物学功能转换有关；Prevotella过度增殖与生殖道慢性低度炎症相关，可能诱发炎症反应和ROS积累而损伤精子；Nesterenkonia携带病原相关分子模式并编码超氧化物歧化酶和过氧化氢酶，能耐受高ROS环境并持续释放代谢产物，可能促进IOA风险；[Eubacterium]_oxidoreducens_group整体呈正向效应，但相关生殖研究稀缺，具体作用需进一步探索。功能预测提示微生物代谢重编程可能破坏精液微环境稳态，保护性菌属耗竭与风险菌属富集可能共同驱动厌氧糖酵解和膜运输潜力的增强，促进促炎产物释放。研究局限性包括单中心横断面设计、样本量有限、仅依赖16S rRNA功能预测缺乏多组学和体外实验验证、模型仅经内部验证缺乏外部验证。未来需开展大规模多中心研究，结合宏基因组学和代谢组学，并通过细胞实验和动物模型验证关键代谢通路破坏介导精子损伤的具体机制。
研究结论部分明确指出：Blautia、Prevotella、Bacteroides、Nesterenkonia和[Eubacterium]_oxidoreducens_group具有区分IOA患者与FC的潜力，可作为预测性微生物生物标志物。这些微生物差异可能参与免疫功能障碍和代谢重编程，尤其是糖酵解/糖异生通路，为IOA中精液微生物组失调提供了新见解。其中Blautia为保护因素，而Prevotella、Nesterenkonia和[Eubacterium]_oxidoreducens_group为风险因素。未来研究应优先在独立队列中临床验证这些生物标志物，并将其整合至非侵入性筛查方案中，以改善IOA的早期诊断，并深化对微生物因素在男性生殖健康中作用的认识。
