# 中文标题 滑液囊支原体重组酶辅助扩增-侧向流试纸条（RAA-LFD）快速可视化检测方法的建立与评价

《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Development and evaluation of a recombinase-aided amplification-lateral flow dipstick assay for rapid and sensitive detection of Mycoplasma synoviae

　　

# 摘要翻译

研究背景：滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）是一种重要的禽类病原体，给全球家禽生产造成巨大的经济损失。MS疫情的及时防控在很大程度上依赖于快速、灵敏且准确的诊断方法，而常规检测手段仍存在耗时和操作繁琐的不足。因此，研究人员开发了一种基于重组酶辅助扩增（recombinase-aided amplification，RAA）结合侧向流试纸条（lateral flow dipstick，LFD）的MS可视化现场检测系统（RAA-LFD-MS检测方法）。

方法：根据RAA引物和外切探针的设计规则，针对MS vlhA基因（可变脂蛋白血凝素A基因）的保守区域设计了特异性引物和探针。构建了含有靶标片段的重组质粒作为阳性标准品。经引物-探针筛选后，对引物浓度、探针浓度、反应温度和孵育时间等关键反应参数进行了系统优化。对所建方法的分析特异性、灵敏度和重复性进行了全面评估。为进一步评价RAA-LFD-MS检测方法的临床性能，研究人员使用该新建方法、常规聚合酶链式反应（polymerase chain reaction，PCR）和实时荧光定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）对共计100份疑似MS感染的临床样本进行了平行检测。

结果：RAA反应在37°C恒温条件下20 min内完成，扩增产物通过侧向流试纸条在3–5 min内即可肉眼判读，无需复杂仪器设备。包括DNA提取步骤在内的总检测时间在40 min内完成。方法学验证表明，RAA-LFD检测方法具有高特异性，与其它常见禽类病原体无交叉反应。该方法还显示出良好的重复性和高灵敏度，检测限（limit of detection，LOD）为2.63×10⁰ copies/μL。在临床样本评价中，RAA-LFD与PCR的符合率为96%，与qPCR的一致性达到100%。

结论：综上所述，所建立的RAA-LFD检测方法快速、操作简便、特异性强、灵敏度高。为进一步推动RAA-LFD-MS检测方法在常规临床和现场中的应用，未来的工作应优先优化快速DNA提取方案、便捷的温控装置以及试剂冻干工艺。

# 论文解读

## 一、研究背景与意义

滑液囊支原体（Mycoplasma synoviae，MS）是全球养禽业中最重要的禽类病原体之一，感染后可导致呼吸道炎症、滑膜炎和骨关节炎等临床症状，并引起生长迟缓、产蛋下降和畸形蛋增多等生产问题，造成严重的经济损失。该病原体可通过种鸡垂直传播给后代，也可通过直接呼吸道接触水平传播，同时感染会降低宿主免疫力，显著增加继发感染其他病原体的风险。因此，准确、高效的检测方法是MS疫病识别、预防和控制的前提。

目前，MS的常规实验室检测技术主要包括病原分离培养、血清学检测和分子生物学方法。病原分离培养虽然是临床诊断的金标准，但通常需要3–4周才能完成，难以满足快速诊断的需求，且体外培养对培养基成分要求严格。血清学检测依赖于感染后宿主产生的特异性抗体，但这些抗体通常仅在感染后2–3周才能有效检出，对早期感染诊断存在明显局限。PCR和qPCR检测快速高效，数小时内即可获得准确诊断结果，已成为MS分子检测的主流技术，然而此类方法依赖昂贵的热循环仪和严格的专业实验室条件。为克服上述缺陷，适用于MS检测的等温核酸扩增技术已被开发，如聚合酶螺旋反应（polymerase spiral reaction，PSR）和环介导等温扩增（loop-mediated isothermal amplification，LAMP），但这些技术仍存在扩增时间需40–60 min、LAMP需设计六条互补引物等不足。

在此背景下，开发一种简便、快速的MS检测技术具有重要的现实意义和迫切需求。重组酶辅助扩增（recombinase-aided amplification，RAA）是一种新兴的等温核酸扩增技术，可在37–42°C恒温条件下于15–30 min内快速完成核酸扩增。当反应体系中引入特异性探针后，扩增产物可通过侧向流试纸条（lateral flow dipstick，LFD）便捷、可视化地检测。因此，研究人员开展了本研究，旨在建立一种快速、高特异性、高灵敏度的RAA-LFD-MS检测方法，为MS的临床诊断和现场检测提供新的技术工具。

## 二、关键技术方法概述

研究人员首先从NCBI检索多条MS vlhA基因序列进行多序列比对，筛选高度保守区域，以参考序列AF035624.1的1037–1606 bp片段为靶标区域。使用Oligo 7.0软件设计四对特异性RAA引物和两条含有四氢呋喃（tetrahydrofuran，THF）修饰位点的Nfo探针，探针5′端标记FAM荧光基团，3′端以C3磷酸化封闭。通过基础RAA扩增和琼脂糖凝胶电泳筛选最优引物对，再利用LFD在无模板条件下验证探针是否存在非特异性信号。构建含有vlhA靶标片段的重组质粒pMD19-vlhA作为阳性标准品，转化至大肠杆菌DH5α感受态细胞，经菌落PCR和Sanger测序验证后，使用超微量分光光度计测定质粒浓度并计算拷贝数。随后对引物浓度、探针浓度、反应温度和孵育时间四个关键参数进行梯度优化实验。方法学评价包括：以11种禽类常见病原体和环境菌基因组DNA为模板进行特异性评估；以10倍梯度稀释的重组质粒标准品（2.63×10⁷–2.63×10⁰ copies/μL）为模板，比较RAA-LFD、常规PCR和qPCR的灵敏度；以高、中、低三种浓度质粒标准品进行批内和批间重复性测试。临床评价采用来自中国新疆维吾尔自治区石河子市三个商业肉鸡场的100份喉拭子样本（采集自表现跛行、呼吸困难、关节肿胀和生长迟缓等典型临床症状且未接种过MG和MS疫苗的鸡只），直接提取基因组DNA后，平行进行RAA-LFD、常规PCR和qPCR检测。

## 三、研究结果

**RAA-LFD检测策略**：研究人员通过多序列比对筛选MS vlhA基因的高度保守区（参考序列AF035624.1第1037–1606 bp）作为靶标区域，据此设计了特异性RAA引物对和携带THF修饰位点的Nfo探针。待检样本经商业DNA提取试剂盒在15 min内获取基因组模板，RAA反应混合物在37°C水浴中等温扩增20 min，期间Nfo核酸酶识别并切割探针上的THF残基，释放出双重FAM/生物素标记的扩增产物。反应液用PBS缓冲液1:6稀释后加载至侧向流试纸条进行免疫层析反应：金纳米颗粒偶联的抗FAM抗体结合靶标产物的FAM标签，检测线上的固定化生物素配体捕获生物素部分，质控线验证液体流动有效。检测线和质控线同时显色为阳性结果，仅质控线显色为阴性结果。

**引物和探针筛选**：四对引物经基础RAA扩增和琼脂糖凝胶电泳分析，引物对MS F2/MS R2产生的条带单一、明亮清晰且非特异性条带最少，被确定为最优引物对。探针筛选显示，两条候选探针均能在LFD上产生清晰的阳性检测带，但MS-Probe 1在无模板DNA条件下出现非特异性假阳性信号，因此选择引物对MS F2/MS R2与MS-Probe 2的组合用于后续实验。

**RAA反应条件优化**：引物浓度梯度实验表明，在0.5–4 μM范围内均可观察到目标条带，2–4 μM时条带强度更高，确定最优引物浓度为2 μM。探针浓度优化显示，0.5–4 μM范围内均可检出可见条带，1–4 μM信号更亮，选择最低有效浓度1 μM为最优探针浓度。反应温度优化表明，30–41°C范围内均出现阳性条带，37–41°C信号更强，确定37°C为最优反应温度。反应时间优化显示，10–30 min内均可观察到清晰目标条带，20–30 min时条带强度最高，采用更短且高效的20 min作为最优反应时长。

**特异性试验**：以4株MS分离株以及鸡毒支原体（Mycoplasma gallisepticum，MG）、牛支原体（Mycoplasma bovis，Mb）、多杀性巴氏杆菌、溶血性曼氏杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门菌、大肠杆菌、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌和屎肠球菌的基因组DNA为模板，在优化条件下进行RAA-LFD检测。结果显示，仅所有MS菌株DNA成功扩增出目标条带，其他病原菌DNA均未出现可见条带，表明所建方法具有高特异性，与常见病原微生物无交叉反应。

**RAA-LFD、PCR和qPCR的灵敏度比较**：以10倍梯度稀释的重组质粒标准品为模板进行三种方法的平行检测。结果显示，RAA-LFD的检测限为2.63×10⁰ copies/μL，常规PCR的检测限为2.63×10³ copies/μL，qPCR的检测限为2.63×10⁰ copies/μL。RAA-LFD的灵敏度与qPCR相当，且比常规PCR高约1000倍。

**重复性试验**：使用高浓度（2.63×10⁴ copies/μL）、中浓度（2.63×10³ copies/μL）和低浓度（2.63×10² copies/μL）的重组质粒标准品进行批内和批间重复性评估。批内重复性试验中，所有浓度下的三个平行重复均成功扩增出目标条带，且同一浓度下各重复的条带强度高度一致。批间重复性试验中，三次独立实验在所有浓度下均稳定扩增出目标片段，不同批次间的条带强度高度一致，表明该方法具有良好的重复性和稳定性。

**临床样本检测**：采用RAA-LFD、常规PCR和qPCR三种方法对100份疑似MS感染的临床喉拭子样本进行平行检测。RAA-LFD检出阳性率为48%（48/100），PCR为44%（44/100），qPCR为48%（48/100）。RAA-LFD与PCR的检测符合率为96%，与qPCR的一致性达100%。所有44份PCR阳性样本均被RAA-LFD检出阳性，阳性符合率为100%；56份PCR阴性样本中52份RAA-LFD亦为阴性，阴性符合率为92.9%。RAA-LFD与PCR的kappa值为0.92，表明两者几乎完全一致。上述结果证实RAA-LFD检测方法可用于临床样本中MS的检测。

## 四、讨论与结论

在讨论部分，研究人员指出所建立的RAA-LFD-MS检测方法具有多方面优势。在灵敏度方面，该方法的LOD达2.63×10⁰ copies/μL，与qPCR相当且比常规PCR高约1000倍，使其能够在低病原载量条件下（包括亚临床感染和早期感染）实现可靠检测。与已报道的MS等温扩增技术（LAMP和PSR通常需40–60 min）相比，RAA-LFD在37°C下仅需20 min即可完成扩增，3–5 min内实现LFD可视化判读，在速度和简便性方面具有明显优势。同时，该方法无需热循环仪和专业实验室条件，拓展了在资源有限环境和现场监测中的应用前景。特异性方面，严格的vlhA基因保守区引物探针设计确保了该方法仅对MS基因组DNA特异扩增，与其他常见禽类病原体无交叉反应，这对MS常与其他病原体混合感染的临床情况尤为重要。重复性评价显示批内和批间变异均高度一致，与已报道的禽类和家畜病原体RAA检测方法相当。在100份临床样本评价中，RAA-LFD与qPCR的符合率达100%，与PCR的kappa值为0.92，证明了其高诊断准确性和临床适用性。

研究结论部分明确指出：所建立的RAA-LFD-MS检测方法是一种快速、操作简便、高特异性、高灵敏度和重复性良好的MS可视化检测方法。与常规PCR和qPCR相比，该方法不依赖大型精密热循环仪，仅需简单加热设备即可完成反应，使其成为资源有限的基层兽医实验室和养殖场进行MS检测的稳健实用的辅助筛查工具。值得注意的是，为推动RAA-LFD-MS检测方法在常规临床和现场应用中的进一步发展，未来应着重优化快速DNA提取方案、便携易操作的温控仪器以及稳健的试剂冻干保存工艺。