《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Circulating Helicobacter pylori extracellular vesicles in serum as biomarkers of infection
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摘要专业翻译
胃部感染幽门螺杆菌（H. pylori）与胃外病理改变相关。幽门螺杆菌可通过产生细胞外囊泡（Hp-EVs）促进这些病理改变的发生，Hp-EVs能够穿越生物屏障并通过血液循环进入其他组织。然而，人类血液循环中是否存在Hp-EVs尚未得到证实。研究人
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胃部感染幽门螺杆菌（H. pylori）与胃外病理改变相关。幽门螺杆菌可通过产生细胞外囊泡（Hp-EVs）促进这些病理改变的发生，Hp-EVs能够穿越生物屏障并通过血液循环进入其他组织。然而，人类血液循环中是否存在Hp-EVs尚未得到证实。研究人员从未感染和感染患者的血清中分离并表征了细胞外囊泡（EVs），并使用免疫印迹（IB）鉴定宿主细胞来源EVs（h-EVs）和Hp-EVs的标志物。研究人员还评估了使用抗脲酶B亚基（UreB）抗体的IB检测对幽门螺杆菌感染真阳性病例的预测能力。最后，研究人员将IB-UreB与其他血液样本中幽门螺杆菌检测方法的诊断效用进行了比较。三十名有症状的个体接受了内镜检查、胃活检和血液检测。快速脲酶试验（RUT）、病理学分析和GastroPanel?（GP）将16例（53.3%）患者归类为幽门螺杆菌阳性。在这些患者血清中分离的所有EVs中均检测到EV标志物CD63和CD81。此外，在62.5%的幽门螺杆菌感染患者中检测到UreB+ EVs，这首次提供了人类血清中存在循环Hp-EVs的证据。在所评估的血液生物标志物中，IB-UreB+被证明是诊断幽门螺杆菌阳性病例的最佳方法。此外，将IB-UreB+与GP联合使用可提高其诊断价值。该研究结果首次提供了人类血清中存在循环Hp-EVs的证据，从而支持了细菌毒力因子系统性播散的机制。此外，在血液样本中检测Hp-EVs可能实现幽门螺杆菌感染的微创诊断。
论文解读
一、研究背景与研究目的
幽门螺杆菌（Helicobacter pylori，H. pylori）是全球范围内最常见的人类感染细菌之一，是一种螺旋形、微需氧、革兰氏阴性菌，定植于人类胃部。虽然大多数感染者无症状，但在某些情况下，该感染可能诱发多种胃部疾病，包括胃炎、消化性溃疡、黏膜相关淋巴组织淋巴瘤（MALT）和胃腺癌。此外，幽门螺杆菌感染还与多种胃外疾病相关，如血液系统疾病、皮肤病、眼科疾病和神经退行性疾病。
幽门螺杆菌能够释放细胞外囊泡（Hp-EVs），其尺寸范围为20至450 nm。由于尺寸微小，Hp-EVs被认为能够穿越多种生物屏障，从胃部进入血液，进而到达其他器官和组织。Hp-EVs包含细菌毒力因子，因此其本身也被视为毒力因子。然而，此前尚无实验证据表明Hp-EVs能够穿越胃部上皮/内皮屏障并到达感染者的血液中。已有少数研究报道了循环系统中存在来源于致病细菌的EVs，但区分病原体来源EVs与宿主细胞来源EVs（h-EVs）存在较大难度，因为二者在尺寸范围上存在显著重叠，且血液中h-EVs的数量远多于细菌来源EVs。
研究人员此前的研究已证明，Hp-EVs可在体外和小鼠模型中诱导星形胶质细胞增生和神经元损伤，且静脉注射和灌胃给药后Hp-EVs可出现在小鼠大脑中。蛋白质组学分析显示，脲酶（Urease）是Hp-EVs中最丰富的蛋白质之一。然而，这些结果基于临床前模型，尚缺乏Hp-EVs在人类感染者血液中存在的直接证据。因此，本研究旨在：1）首次提供人类循环中存在Hp-EVs的直接证据；2）提出通过血液检测Hp-EVs作为识别幽门螺杆菌现症感染的潜在微创诊断方法。
二、主要关键技术方法
研究人员首先从幽门螺杆菌60190菌株液体培养物中纯化Hp-EVs，用于评估候选标志物的检测灵敏度。随后，研究人员比较了三种血清EVs纯化方案，最终优化出一种基于尺寸排阻色谱（qEV柱）的方法，并采用Amicon超滤管浓缩样品，以PVP-40预处理滤膜以减少非特异性吸附。EVs表征采用纳米颗粒追踪分析（NTA）、扫描电子显微镜（SEM）、BCA蛋白定量和免疫印迹（IB）等技术。临床样本来源于智利Curico的San Juan de Dios医院和Puerto Montt医院的三十名有消化道症状的患者，所有患者均接受了上消化道内镜、胃活检、快速脲酶试验（RUT）和血液检测。
三、研究结果
3.1 发现检测人血清中幽门螺杆菌细胞外囊泡的生物标志物
研究人员对纯化的Hp-EVs进行梯度浓度免疫印迹分析，比较CagA、UreB和VacA三种毒力因子的检测灵敏度。结果显示，CagA可在低至150 ng的Hp-EVs总蛋白中被检测到，UreB可在更低浓度（50 ng）下被检测到，而VacA仅在1500 ng时才可检测到。UreB是三者中最优的Hp-EVs检测标志物。
3.2 人血清细胞外囊泡的纯化
研究人员比较了三种血清EVs纯化方案：UC-qEV（超速离心联合尺寸排阻色谱）、qEV（单纯尺寸排阻色谱）和qEV2（双重尺寸排阻色谱）。结果显示，qEV方案在EVs浓度、总蛋白浓度和CD81检测方面表现最佳。经优化后，该方案采用30 kDa MWCO超滤管将三个洗脱组分浓缩至约70 μl。优化方案中，组分3的颗粒浓度和蛋白浓度最高，且CD63和CD81标志物信号最强。
3.3 患者临床数据
三十名患者中，16例（53.3%）经RUT和病理报告确认为幽门螺杆菌阳性（Hp+），14例为阴性（Hp-）。两组在年龄和性别分布上无显著差异。患者来自智利胃癌高风险和幽门螺杆菌感染高流行地区。
3.4 感染与未感染患者血清来源EVs的表征
NTA分析显示，Hp+和Hp-两组患者的EVs在平均尺寸和颗粒浓度上无显著差异。但Hp+患者EVs的总蛋白浓度显著低于Hp-患者。SEM验证了EVs典型的囊泡状圆形形态和尺寸，Hp-样本平均尺寸为150±7 nm，Hp+样本为129±9 nm，感染个体倾向于产生稍小的囊泡。
3.5 人血清EVs中幽门螺杆菌脲酶的纳克级免疫检测
在所有患者的血清来源EVs中均检测到CD63和CD81标志物，证实了纯化流程和检测方法的可靠性。在62.5%的幽门螺杆菌真阳性患者中检测到UreB阳性EVs（IB-UreB+），首次提供了人类血液中存在循环Hp-EVs的证据。
3.6 GastroPanel?（GP）
GP检测了胃蛋白酶原I/II比值（PGI/PGII）、胃泌素17（Gastrin17）和抗幽门螺杆菌抗体（anti-Hp antibodies）。结果显示，仅11名患者检测到循环抗幽门螺杆菌抗体，各指标异常情况不一。
3.7 基于UreB阳性囊泡免疫检测的幽门螺杆菌感染诊断
单因素和多因素逻辑回归分析显示，IB-UreB+检测是最强的预测因子（OR=10.00，95%CI: 1.899-80.35，P=0.0125），其AUC为0.74±0.09，优于GP（AUC=0.64±0.10），且是唯一在统计上显著优于仅截距模型的单个标志物。IB-UreB+单独检测的敏感性为62.50%，特异性为85.71%，PPV为83.33%，NPV为66.67%，准确率为73.33%。GP与IB-UreB+联合模型（多变量模型）实现了最高的AUC（0.80±0.09），敏感性为81.25%，特异性为71.43%，PPV为76.47%，NPV为76.92%，准确率为76.67%。模型选择分析（AICc）确认IB-UreB+单独检测（ΔAICc=-5.43）和GP+IB-UreB+联合模型（ΔAICc=-4.39）是唯一具有统计学支持的诊断方法。
四、讨论与结论
本研究的讨论部分指出，Urease是Hp-EVs中最丰富的毒力因子之一，可作为检测Hp-EVs的最佳抗原。与Shimoda等人（2016）报道的CagA作为血清EVs中唯一生物标志物不同，本研究首次报道了人类血液中存在Hp-EVs的直接证据。这一差异可能归因于方法学差异，包括不同的质谱分析、EVs纯化方法或患者队列的临床特征差异。
研究存在以下局限性：1）检测到的UreB阳性囊泡的细菌来源是基于免疫检测推断的，而非通过独立分析方法确认；2）所有血清样本在-80°C下储存了约五年，长期储存可能影响囊泡完整性和蛋白质稳定性，可能导致UreB阳性率被低估。
研究结论：本研究优化了一种基于尺寸排阻色谱的血清EVs纯化方案，首次提供了人类循环中存在Hp-EVs的直接证据，并证明通过免疫印迹检测血清EVs中的UreB（IB-UreB+）是一种有前景的幽门螺杆菌感染微创诊断方法。将IB-UreB+与GastroPanel联合使用可进一步提高诊断性能，为幽门螺杆菌感染的液体活检提供了新思路。
