内生微生物Acinetobacter lwoffii MA1通过膜蛋白介导的吸附作用改变菠菜（Spinacia oleracea）镉含量

《Frontiers in Microbiology》：Endophytic microbe Acinetobacter lwoffii MA1 alters the cadmium content in Spinacia oleracea through membrane proteins-mediated adsorption

　　

菠菜、芹菜、水菠菜和食用菌等蔬菜更容易积累重金属。虽然蔬菜中重金属积累的机制以及其是否与内生微生物相关仍不清楚。在本研究中，研究人员从菠菜种子中分离出一株对镉具有耐受性的内生微生物A. lwoffii MA1。盆栽实验表明，用A. lwoffii MA1富集种子使菠菜中的镉含量从0.82 mg/kg增加到0.94 mg/kg，而微生物测序计数从139.77增加到247.82，表明添加A. lwoffii MA1会影响菠菜中的镉水平。与未接种的对照相比，接种A. lwoffii MA1提高了菠菜根际土壤的微生物多样性，表明该内生菌株的引入对本地土壤微生物群落具有正向调节作用。随后利用扫描电子显微镜（SEM）、衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）、亲和色谱和质谱对吸附机制的分析表明，A. lwoffii MA1通过带负电荷的细胞表面基团（如氨基和羧基）捕获带正电荷的Cd²⁺。此外，细胞膜中的三种膜蛋白也可能在吸附过程中发挥重要作用，包括TonB依赖性受体、RND转运蛋白AdeIJK和外膜蛋白组装因子BamD。这些结果为内生微生物对镉积累的影响提供了新的见解，为降低菠菜和其他蔬菜中镉含量提供了一种有前景的方法。

**一、研究背景与科学问题**

随着化学肥料和农药的大量使用，以及工业废水、采矿活动和大气重金属沉降等污染因素的影响，中国土壤重金属污染问题日益严重。镉（Cadmium, Cd）是一种具有强迁移性且对人和动物非必需的有毒重金属，其在土壤-植物系统中具有高度移动性，即使低浓度也可对植物和微生物造成损害。Cd污染通过土壤向植物迁移进入食物链，最终危害人类健康。菠菜（Spinacia oleracea）作为一种叶菜类蔬菜，具有宽大绿叶、生长快、金属积累能力高的特点，易于受到Cd污染。内生细菌（endophytic bacteria）是指在不引起可见症状的情况下定殖于健康植物各组织和器官内部的细菌，相较于根际和叶际细菌，内生菌能为宿主植物提供更好的生物和非生物胁迫保护。已有研究表明，水稻对Cd的吸附和转运与其内生微生物群落密切相关，植物内生菌在重金属的解毒和转运过程中发挥关键作用。然而，如何通过植物自身有效降低蔬菜中Cd含量仍不清楚。由于内生微生物存在于迄今研究的所有植物物种中，且在植物健康与发育中发挥重要作用，研究人员推测植物内生微生物可能影响Cd含量。基于此，本研究从菠菜种子中筛选、分离和鉴定具有Cd吸附能力的内生菌株，通过盆栽实验评估其对菠菜Cd吸附的影响，并研究内生菌对Cd的吸附机制，旨在为利用内生细菌进行作物重金属解毒研究奠定基础，为可持续农业发展铺平道路。

**二、研究内容与主要结论**

研究人员通过表面消毒处理菠菜种子，从种子内部成功分离出10株可培养内生细菌菌株，并进一步通过含Cd培养基筛选获得一株具有强Cd耐受性的菌株MA1。基于16S rDNA序列分析和系统发育分析，该菌株与A. lwoffii strain EK30A的相似性为98.59%，被鉴定并命名为Acinetobacter lwoffii MA1（A. lwoffii MA1）。体外Cd吸附实验表明，在与40 mg/L Cd²⁺孵育48小时后，上清液中Cd²⁺浓度仅为1.378 mg/L，吸附容量达到94.36%。EDTA洗脱实验显示，洗脱前后细胞中Cd²⁺含量分别为3.24 mg/g和0.37 mg/g，其中88.58%的吸附Cd存在于细胞外膜组分中，表明外膜蛋白可能对Cd²⁺的固定起主要作用。

在温室盆栽实验中，研究人员设置了对照组（CK）、Cd处理组（Cd）和Cd+MA1接种组（Cd+MA1）三个处理。结果显示，Cd胁迫严重抑制了菠菜生长，导致叶片卷曲黄化。接种A. lwoffii MA1的菠菜种子在Cd污染土壤中生长后，菠菜叶片中Cd含量从约0.822 mg/kg增加至0.941 mg/kg，提高了14.5%。利用多核苷酸多态性（Multiple Nucleotide Polymorphism, MNP）标记分析发现，经A. lwoffii MA1富集的种子种植后，菠菜叶片中该菌的相对含量显著升高——在普通土壤中从69.473增加至247.823（增加256%），在Cd污染土壤中从139.277增加至247.823（增加77.9%）。上述结果表明，菠菜叶片中A. lwoffii MA1的丰度与Cd含量呈正相关关系，内生菌的种群数量影响植物吸收的Cd量。

对根际土壤微生物群落分析显示，Cd污染显著降低了土壤细菌群落的物种丰富度和系统发育多样性，而接种A. lwoffii MA1有效缓解了Cd对丰富度的负面影响，使其几乎恢复到对照水平，但对群落均匀度的改善不显著。在门水平上，三个处理组的优势菌门为Bacteroidetes、Proteobacteria和Actinobacteriota，Cd处理组群落组成明显不同于对照组，而Cd+MA1组的群落结构部分恢复至接近对照组。在属水平上，MA1处理增加了Pricia、Actinomadura、Rhodanobacter、Lysobacter、Luteimonas、Salinimicrobium和Arenibacter等有益功能菌属的相对丰度，同时降低了Saccharimonadales、Bacillus和Geobacillus等菌属的相对丰度。值得注意的是，在土壤样品中未检测到A. lwoffii，该菌仅存在于菠菜叶片内部，证实其作为菠菜内生菌的专一性定殖特征。

**三、主要关键技术方法**

本研究涉及的关键技术方法包括：(1) 16S rDNA序列分析和全基因组鸟枪法测序用于菌株鉴定与系统发育分析；(2) 电感耦合等离子体发射光谱仪（ICP-OES）用于测定Cd含量；(3) 多核苷酸多态性（MNP）标记结合二代测序用于定量目标菌株在植物组织中的丰度；(4) 16S rRNA基因扩增子高通量测序用于分析根际土壤微生物多样性；(5) 扫描电子显微镜（SEM）结合能谱分析（EDS）用于观察菌体形态和元素分布；(6) 衰减全反射傅里叶变换红外光谱（ATR-FTIR）用于分析细胞表面官能团变化；(7) 化学掩蔽法用于选择性封闭细胞表面氨基、羧基和磷酸基团以评估其各自对Cd²⁺吸附的贡献；(8) 基于Cd²⁺亲和层析柱的膜蛋白纯化结合SDS-PAGE和反相液相色谱-质谱联用（RPLC-MS）用于分离和鉴定Cd吸附相关膜蛋白。

**四、研究结果**

**4.1 内生细菌的分离与鉴定。** 从菠菜种子中分离出10株内生细菌，通过40 mg/L和80 mg/L Cd²⁺梯度筛选获得一株高耐受菌株MA1。16S rDNA序列比对显示其与A. lwoffii strain EK30A相似性达98.59%，系统发育分析确认其属于Acinetobacter属，命名为A. lwoffii MA1。

**4.2 A. lwoffii MA1的Cd吸附能力。** 在40 mg/L Cd²⁺条件下，A. lwoffii MA1在48小时内去除上清液中94.36%的Cd²⁺。EDTA洗脱实验表明88.58%的吸附Cd存在于外膜组分中，提示外膜蛋白在Cd²⁺固定中起主要作用。

**4.3 内生菌富集提高菠菜Cd含量。** 盆栽实验表明，Cd胁迫抑制菠菜生长导致叶片卷曲黄化。接种A. lwoffii MA1的菠菜叶片Cd含量从0.822 mg/kg增加至0.941 mg/kg（提高14.5%）。MNP分析显示，内生菌富集使菠菜叶片中A. lwoffii MA1含量显著增加（普通土壤中增加256%，Cd污染土壤中增加77.9%），且内生菌丰度与Cd含量呈正相关。

**4.4 菠菜根际土壤细菌群落分析。** Cd污染显著降低了土壤细菌群落的Chao1和Observed species指数，而MA1接种使这些指数几乎恢复至对照水平。在门和属水平上，MA1接种部分恢复了Cd污染导致的群落结构变化，增加了多种有益功能菌属的相对丰度，并抑制了某些耐受菌的过度生长。土壤中未检测到A. lwoffii，确认其为菠菜专性内生菌。

**4.5 A. lwoffii MA1的Cd吸附特征。** SEM观察显示，Cd²⁺暴露导致菌体表面出现凹陷和皱缩但无孔洞形成，EDS分析证实C、O、N、P、S和Cd等元素存在于细胞表面。ATR-FTIR光谱分析表明，Cd²⁺结合导致氨基（–NH₂）、羟基（–OH）、羧基（–COOH）和磷酸二酯基团的特征峰发生显著变化，这些官能团为Cd²⁺提供了多种结合位点。

**4.6 膜蛋白对Cd吸附的机制研究。** 化学掩蔽实验显示，掩蔽氨基使Cd吸附率显著降低50.46%，掩蔽羧基使吸附率降低4.42%，掩蔽磷酸基团对吸附率无显著影响，表明氨基和羧基是Cd²⁺吸附的关键官能团。通过Cd²⁺亲和层析纯化和RPLC-MS鉴定，获得三种Cd吸附相关膜蛋白：TonB依赖性受体（TonB-dependent receptor，75.79 kDa）、多药外排RND转运蛋白AdeIJK（Multidrug efflux RND transporter AdeIJK，53.15 kDa）和外膜蛋白组装因子BamD（Outer membrane protein assembly factor BamD，36.28 kDa），它们通过不同机制参与Cd²⁺的吸附和解毒。

**五、讨论与结论**

讨论部分指出，种子是内生细菌的重要来源，种子传播的内生菌能够快速定殖新一代植物。有研究表明，水稻种子中筛选出的Cd抗性内生菌属在水稻其他部位同样存在。本研究中，研究人员通过表面消毒排除了附生微生物的干扰，从菠菜种子中获得高Cd耐受性内生菌A. lwoffii MA1。Cd对植物具有毒性效应，导致生长抑制、叶片卷曲和黄化等表型变化，这与盆栽实验结果一致。更重要的是，内生菌丰度与菠菜中Cd含量呈正相关——正常种子在正常土壤中种植时A. lwoffii MA1和Cd含量最低；正常种子在高Cd土壤中种植时两者含量均升高；内生菌富集种子在高Cd土壤中种植时两者含量最高。这一发现表明内生细菌数量的增加可促进蔬菜可食用部分重金属的积累，因此可通过降低菠菜种子中A. lwoffii MA1的比例来减少植物对Cd的吸收，提高蔬菜食用安全性。在吸附机制方面，Cd²⁺首先通过静电吸引和官能团配位作用快速固定在细胞表面；随后部分Cd²⁺被转运进入细胞质；当胞内Cd含量升高时，细胞激活外排系统维持Cd稳态。氨基和羧基是A. lwoffii MA1表面吸附Cd²⁺的主要官能团，与先前研究中其他菌株的结果存在一定差异，这可能与菌株表面官能团特征不同有关。此外，A. lwoffii MA1细胞表面的胞外聚合物也可能在保护细菌免受重金属毒性中发挥作用。细胞膜上极性氨基酸残基（如谷氨酸的羧基、半胱氨酸的巯基和组氨酸的咪唑基）能够通过静电相互作用或配位键直接捕获Cd²⁺。本研究鉴定出的三种膜蛋白中，TonB依赖性受体具有β-桶跨膜结构域和含底物特异性结合口袋的胞外环，可通过胞外结合位点直接配位吸附游离Cd²⁺或识别Cd-有机复合物；RND转运蛋白AdeIJK可能通过直接外排重金属离子、调节生物膜形成和间接促进吸附等机制参与Cd²⁺的吸附与解毒；外膜蛋白组装因子BamD可能通过调控重金属转运相关外膜蛋白的组装和维持外膜完整性参与Cd²⁺的吸附过程。

研究结论部分可翻译为：基于上述分析，研究人员提出了一种内生微生物A. lwoffii MA1增加菠菜Cd吸附的可能机制。在Cd诱导的胁迫下，A. lwoffii MA1启动生物吸附作用，通过其表面带负电荷的细胞基团（如氨基和羧基）捕获带正电荷的Cd²⁺。此外，细胞膜中的三种膜蛋白在吸附过程中发挥主要作用，包括TonB依赖性受体、RND转运蛋白AdeIJK和外膜蛋白组装因子BamD。本研究也存在若干局限性：首先，实验在受控温室条件下的盆栽中进行，可能无法完全代表田间复杂环境因素对Cd生物有效性和细菌性能的影响；其次，评估仅限于单一菌株A. lwoffii MA1，其他内生菌株或土壤微生物共接种的效果尚不清楚；第三，菠菜叶片中Cd含量增加虽然证明了该菌株可影响Cd积累，但也引发食品安全方面的担忧。未来研究应涵盖不同土壤类型和环境条件下的田间尺度试验，评估不同菌株组合的效果，并研究在保持有益促生效应的同时限制Cd向可食用部分转运的策略。