《Frontiers in Immunology》：Fibrinogen depletion prevents non-dissociable cell aggregates of feeder-derived NK cell products
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**摘要**
**引言：** 自然杀伤细胞（natural killer cells, NK cells）作为先天免疫系统的关键组成部分，在癌症免疫治疗中展现出巨大的应用潜力。目前，经辐照的基因修饰饲养细胞被广泛用于生产大量高细胞毒活性的NK细胞。然而，一个
**摘要**
**引言：** 自然杀伤细胞（natural killer cells, NK cells）作为先天免疫系统的关键组成部分，在癌症免疫治疗中展现出巨大的应用潜力。目前，经辐照的基因修饰饲养细胞被广泛用于生产大量高细胞毒活性的NK细胞。然而，一个常被忽视的问题是，以此方式制备的NK细胞产品在储存和运输过程中易形成不可解离的宏观细胞聚集体，这给临床应用带来了重大挑战。细胞聚集体的形成不仅降低细胞产量和质量，还引发了对血管闭塞或输注相关意外免疫毒性的担忧。
**方法：** 为解决此问题，研究人员系统调查了NK细胞制造全过程中促进聚集体形成的关键因素。研究人员从脐带血或外周血中分离原代NK细胞，并使用饲养细胞进行扩增。研究人员评估了收获参数（离心力、终细胞浓度、过滤孔径及人血清白蛋白浓度）、抗凝剂补充、饲养细胞以及血浆纤维蛋白原含量对聚集体形成的影响。配制后，通过显微镜对聚集体形成进行监测和定量分析。同时，研究人员采用细胞计数器和流式细胞术评估了NK细胞的质量属性，包括细胞凋亡、纯度、增殖及细胞毒功能，以确认NK细胞产品的质量。
**结果：** 研究结果表明，培养基中饲养细胞与纤维蛋白原的共存共同诱导了最终NK细胞产品中的聚集。用无纤维蛋白原的血清替代品替换自体血浆，可有效防止聚集，且不影响NK细胞的扩增倍数、表型稳定性、活力或细胞毒效力。
**结论：** 总之，该研究揭示了饲养细胞来源NK细胞产品中细胞聚集的现象和机制，并建立了一套优化的NK细胞制造方案，为饲养细胞来源NK细胞疗法的临床可行性提供了支持。
**纤维蛋白原去除消除饲养细胞来源NK细胞产品中的细胞聚集：机制解析与工艺优化**
**一、研究背景与科学问题**
自然杀伤细胞（natural killer cells, NK cells）是先天免疫系统的关键组成部分，无需预先致敏即可直接识别并清除肿瘤细胞或病毒感染的细胞，这种快速、非抗原特异性的细胞毒作用使其成为“通用型”癌症免疫治疗的理想效应细胞。然而，NK细胞疗法的广泛临床应用受到功能性NK细胞体外规模化生产的制约。在现有的多种扩增策略中，基于饲养细胞的扩增平台因其能强力支持NK细胞大量增殖而成为最广泛采用的方法。常用策略是使用经辐照灭活但稳定表达膜结合型刺激分子（如IL-21、IL-15）的基因修饰K562细胞作为饲养细胞，在多种激活信号的协同作用下实现NK细胞的高效选择性扩增。
尽管该策略在细胞产量、纯度和细胞毒性方面表现优越，研究人员在自建的饲养细胞扩增体系中却发现了一个此前未被报道的现象：所有来源的NK细胞终产品在配制成制剂后数小时内，均会不可逆地形成肉眼可见的宏观聚集体，且这些聚集体在标准2–8 °C储存期间体积和数量不断增大，无法通过轻柔振摇分散。这一现象对产品安全性构成严重影响，可能增加输注后微血管闭塞或免疫相关不良反应的风险。既往研究多聚焦于NK细胞的产量、纯度及杀伤功能，而忽视了终产品在储存和运输过程中的稳定性。因此，阐明饲养细胞来源NK细胞产品中细胞聚集的形成机制，并据此优化生产工艺，是推动NK细胞疗法临床转化的迫切需求。
**二、研究内容与总体结论**
针对饲养细胞扩增NK细胞终产品中普遍存在的不可解离细胞聚集问题，研究人员对NK细胞制备全过程中的关键因素进行了系统性排查。研究首先证实，无论采用何种饲养细胞体系或NK细胞来源（脐带血或外周血），终产品均会出现聚集，且脐带血来源的细胞聚集率显著高于外周血。对收获和配制参数的优化（如降低离心力、使用更小孔径滤网、降低终细胞浓度、添加人血清白蛋白）仅能部分缓解聚集，无法彻底根除。补充抗凝剂肝素亦非可行策略，低剂量效果不足，高剂量则显著损害NK细胞的增殖和纯度。进一步研究发现，饲养细胞是触发聚集的关键因素——减少饲养细胞数量可剂量依赖性地降低聚集率，而无饲养细胞的细胞因子扩增体系则完全无聚集，但后者在扩增倍数、纯度和杀伤活性上均显著逊于饲养细胞体系。最终，研究揭示了聚集形成的核心机制：培养基中血浆来源的纤维蛋白原与饲养细胞凋亡碎片协同作用，共同驱动了不可逆细胞聚集体的形成。采用无纤维蛋白原的血清替代品（如纤维蛋白原去除的人血小板裂解物，fibrinogen-depleted human platelet lysate, fd-hPL）替换常规血浆或血小板裂解物，可完全消除终产品中的细胞聚集，且不影响NK细胞的扩增倍数、表型纯度、存活率及细胞毒功能，从而建立了一套经优化的、符合GMP要求的NK细胞大规模制造工艺。
**三、主要关键技术方法**
研究人员围绕NK细胞扩增、收获、配制及质量评估建立了系统的技术平台。原代NK细胞来源于健康供体的脐带血或外周血单个核细胞（mononuclear cells, MNCs）（样本由Milecell公司提供），与经100 Gy X射线辐照的K562-4-1BBL-mbIL-21饲养细胞共培养扩增13天。细胞聚集率采用Countstar全自动细胞分析仪结合台盼蓝染色进行盲法定量，并设置8–100 μm粒径阈值及形态学滤镜以排除碎片干扰。纤维蛋白原含量通过人纤维蛋白原ELISA试剂盒检测。NK细胞质量评估采用流式细胞术检测细胞凋亡（Annexin V-FITC/PI）、表面受体表达（CD16、NKp44、NKp46、NKG2D）、脱颗粒标志物（CD107a）及胞内效应蛋白（穿孔素、颗粒酶B），细胞毒活性通过K562-GFP靶细胞共培养体系评估。
**四、研究结果**
**1. 饲养细胞扩增的NK细胞产品形成不可解离聚集体**
研究人员通过慢病毒转导构建了稳定表达4-1BBL和膜结合型IL-21（mbIL-21）的K562饲养细胞系，并建立了NK细胞扩增方案。所有经饲养细胞扩增的脐带血来源NK细胞终产品在2–8 °C储存4小时内均出现宏观不可解离聚集体。为排除自建饲养体系的特异性问题，研究人员在相同培养条件下比较了两种商业化饲养细胞系，三组在扩增倍数、纯度、凋亡率和细胞毒活性方面均无显著差异，但三个组的NK细胞产品均出现聚集。外周血来源的NK细胞在同等条件下虽也形成聚集体，但尺寸和频率显著低于脐带血来源细胞。该结果表明，NK细胞来源和饲养细胞种类均非决定聚集形成的关键因素。
**2. 收集和配制流程优化不足以防止聚集体形成**
鉴于培养过程中几乎未观察到不可逆聚集，研究人员假设聚集可能在细胞收集过程中触发，故系统调整了收获参数。将离心力从500×g降至300×g时，细胞聚集率略有下降，但仍有大量聚集；升至800×g则聚集率显著增加。采用40 μm孔径细胞滤网可适度减少聚集体大小和数量，但无法完全消除。降低终产品细胞密度（2×10?/mL）后聚集率和聚集体尺寸均有所下降。人血清白蛋白（human serum albumin, HSA）的添加与否对聚集有显著影响：不含HSA的产品聚集率高达约65%，但将HSA浓度从1.5%提高至3%并未带来额外改善。将上述优化参数（300×g离心、40 μm过滤、2×10? cells/mL、1.5% HSA）整合应用后，配制后4小时聚集率显著降低，但储存至12小时和24小时时大量聚集体重新出现。此外，低离心力和细孔径滤网的使用会增加细胞损失，影响终产品收获率。该部分研究证明，仅通过工艺参数优化无法从根本上解决聚集问题。
**3. 肝素补充不能防止NK细胞聚集体形成**
鉴于凝血级联因子可能参与聚集过程，研究人员在NK细胞扩增培养体系中测试了不同浓度（0、1、5、10 IU/mL）肝素的补充效果。与预期相反，高剂量肝素（5和10 IU/mL）在培养期间即诱导大量宏观不可解离聚集体的形成，且显著抑制NK细胞增殖、降低细胞纯度，但未显著影响细胞毒活性和凋亡率。低剂量肝素（1 IU/mL）在配制后仅适度降低了聚集率，远未达到完全预防的效果。高剂量肝素组在配制后反而表现出更高的聚集率。该结果表明，肝素补充并非解决饲养细胞来源NK细胞聚集问题的合适策略。
**4. 饲养细胞驱动NK细胞产品中的聚集体形成**
为验证饲养细胞凋亡碎片在聚集中的作用，研究人员在扩增第7天进行了不同NK-饲养细胞比例（10:1、20:1、40:1）的第二轮刺激。结果表明，减少饲养细胞数量不显著影响NK细胞的扩增倍数、纯度或细胞毒性。但最终产品中聚集体的发生率随饲养细胞数量的减少而呈剂量依赖性显著下降，不过该措施未能完全消除聚集。与饲养细胞体系形成鲜明对比的是，仅用细胞因子组合扩增的NK细胞在储存后几乎完全无聚集体形成，即使延长储存时间也未出现聚集。然而，饲养细胞体系在NK细胞扩增产量、纯度和细胞毒活性方面具有显著优势，因此简单地放弃饲养细胞并不利于建立大规模NK细胞生产平台。该部分研究证实饲养细胞是引发聚集的关键触发因素之一。
**5. 纤维蛋白原去除消除饲养细胞扩增NK细胞产品中的聚集体**
鉴于纤维蛋白原是血浆和人血小板裂解物中常见的培养补充成分，且具有结合整合素及DNA/组蛋白复合物的结构能力，研究人员提出纤维蛋白原/纤维蛋白与饲养细胞来源的凋亡碎片协同促进聚集的假说。ELISA检测证实，商业化的纤维蛋白原去除人血小板裂解物（fd-hPL；纤维蛋白原浓度<20 μg/mL）中纤维蛋白原水平显著低于未处理血浆和冻融血浆。将fd-hPL作为培养基补充物后，NK细胞终产品在4、12、24小时储存后均完全无可见聚集体。相比之下，未处理血浆组产品中聚集体丰度显著高于冻融血浆组，表明聚集形成呈纤维蛋白原浓度依赖性。重要的是，三种培养补充物在NK细胞扩增倍数、纯度、细胞毒活性以及表面活化受体（CD16、NKp44、NKp46、NKG2D）、脱颗粒标志物（CD107a）和胞内效应蛋白（颗粒酶B、穿孔素）表达水平方面均无显著差异。该研究明确证实纤维蛋白原是饲养细胞扩增NK细胞产品中聚集体形成的关键决定因素，去除纤维蛋白原可在不影响细胞产量和功能的前提下有效防止聚集。
**五、讨论总结与研究结论**
讨论部分指出，饲养细胞扩增体系中NK细胞产品的不可解离聚集现象对临床安全性构成显著威胁，包括输注相关呼吸困难、寒战、缺氧及潜在的血栓栓塞并发症。研究人员系统排除了收获过程中的机械剪切应力、细胞密度等因素的独立决定性作用，证实这些因素仅可部分缓解聚集。饲养细胞在与NK细胞共培养后发生快速大量凋亡，释放富含细胞外DNA、组蛋白及磷脂酰丝氨酸暴露膜碎片的凋亡碎片，为聚集提供了成核位点。培养基中血浆来源的纤维蛋白原通过与这些碎片协同交联，最终驱动不可逆聚集体的形成。研究同时指出，该方法学上的考虑同样适用于其他细胞治疗产品如间充质基质细胞（mesenchymal stromal cells, MSCs）的规模化制造。该研究尚存一定局限性：聚集体精确组成需通过透射电子显微镜进一步确认；培养阶段不出现明显聚集而收获和储存阶段聚集活跃的原因可能与大体积培养基和低细胞密度限制细胞间接触有关；外周血与脐带血来源NK细胞聚集倾向差异可能归因于不同抗凝剂暴露，肝素有效抑制凝血酶介导的纤维蛋白聚合而柠檬酸钠仅部分抑制凝血级联激活。
研究结论部分表明：该研究首次鉴定出纤维蛋白原是导致饲养细胞扩增NK细胞产品中聚集体形成的关键且此前未被认识的因素。通过使用无纤维蛋白原的补充物替代常规血浆或血小板裂解物，可在不损害NK细胞产量、纯度或活性的前提下有效解决聚集问题。这一简单、可规模化且即可转化的干预策略提高了产品的安全性、稳定性和输注可靠性，从而推进了“通用型”NK细胞疗法的临床可行性和监管准备度。
