RBM15通过NXF1促进E2F1核转运影响脑出血中的线粒体自噬

《Frontiers in Immunology》：RBM15 affects mitophagy in intracerebral hemorrhage by promoting E2F1 nuclear translocation via NXF1

　　

专业术语翻译的论文摘要 核mRNA转运对于维持mRNA稳态和正常细胞功能至关重要；然而，调控E2F转录因子1（E2F1）mRNA核转运的机制仍知之甚少。在本研究中，研究人员表明核RNA转运因子1（NXF1）在Hemin处理的HT22细胞和脑出血（ICH）小鼠中表达上调，提示其参与ICH发病机制。敲低NXF1对Hemin诱导的HT22细胞炎症反应发挥保护作用。一致地，下调NXF1在体内改善了神经功能缺损、减少了细胞死亡并降低了细胞因子水平。机制上，NXF1介导的神经保护作用与线粒体自噬诱导相关。综上所述，研究人员的发现为ICH进展提供了新的见解，并确定RBM15/NXF1/E2F1轴作为ICH干预的潜在靶点。

论文解读文章

研究背景与问题

脑出血（intracerebral hemorrhage, ICH）是一种因脑血管破裂导致的危及生命的疾病。尽管近年来在理解ICH病理生理学及其治疗预防方面取得了显著进展，但临床预后仍然不佳。脑组织损伤和功能损害涉及复杂的病理生理过程，除了血肿造成的原发性机械损伤外，相关的炎症反应被认为是推动脑损伤进展和影响患者预后的关键因素。因此，抑制炎症反应被视为ICH的关键治疗靶点。

m6A甲基化是一种重要的转录后mRNA修饰，由METTL3、METTL16和RBM15/RBM15B等催化。异常的m6A甲基化与多种疾病的发生密切相关，包括非小细胞肺癌、心血管疾病和ICH。已有研究表明，敲低m6A甲基转移酶可显著缓解ICH进展。作为一种新发现的甲基转移酶，RBM15参与多种细胞过程，但其在ICH进展中的确切作用尚不清楚。研究人员前期数据显示，RBM15通过促进E2F1 mRNA的m6A甲基化参与ICH进展。然而，介导E2F1 mRNA核输出的分子机制仍有待完全阐明。

通常，真核生物中mRNA的核输出是由核RNA转运因子1（nuclear RNA transport factor 1, NXF1）和NTF2样输出蛋白1（NTF2-like export protein 1, NXT1）介导的。这些蛋白结合准备输出的mRNA核糖核蛋白复合物，促进其识别并靶向核孔复合体。一旦进入核孔复合体，NXF1-NXT1/p15二聚体在mRNA核转位中发挥关键作用。因此，mRNA核转运紊乱与多种疾病密切相关。既往研究表明，RBM15通过其C端区域与NXF1相互作用，这种相互作用对于增强NXF1结合mRNA的能力至关重要。然而，NXF1是否参与ICH进展，以及其与RBM15的相互作用在E2F1 mRNA核转运中的作用仍不清楚。因此，本研究旨在探讨E2F1 mRNA核输出的机制。

研究内容与结论

研究人员通过一系列实验证实，RBM15与NXF1存在相互作用，并正向调控NXF1的表达水平。在Hemin处理的小鼠海马神经元HT22细胞（体外ICH模型）和ICH小鼠模型中，NXF1均表达上调。敲低NXF1可减轻Hemin诱导的HT22细胞炎症反应，并在体内改善ICH小鼠的神经功能缺损、减少细胞死亡和降低细胞因子水平。机制研究发现，NXF1的下调可通过激活线粒体自噬发挥神经保护作用。进一步研究表明，RBM15和NXF1协同调控E2F1 mRNA的核转运：RBM15的缺失导致E2F1 mRNA在细胞核内滞留，从而减少其在细胞质中的表达。本研究确定了RBM15/NXF1/E2F1这一新的调控轴在ICH发病机制中的关键作用，为ICH的治疗提供了潜在的干预靶点。

主要关键技术方法

研究人员使用了Hemin处理HT22细胞建立体外ICH模型，以及C57/BL6雄性小鼠通过立体定位注射自体股动脉血建立体内ICH模型。主要技术方法包括：免疫共沉淀（Co-IP）和GST pull-down检测蛋白相互作用；RNA免疫沉淀（RIP）结合qPCR检测RNA与蛋白的结合；荧光原位杂交（FISH）和免疫荧光（IF）观察mRNA与蛋白的亚细胞定位；Western blot检测蛋白表达水平；qPCR检测mRNA表达水平；MitoTracker与LC3共染色、JC-1染色、MitoSOX染色评估线粒体自噬、线粒体膜电位和活性氧水平；ELISA检测细胞因子水平；TUNEL和Fluoro-Jade C染色检测细胞凋亡和神经元损伤；以及STRING数据库预测蛋白互作网络。

研究结果

RBM15与NXF1相互作用并调节其表达水平

通过STRING数据库预测到RBM15的相互作用蛋白，其中重点关注了核mRNA转运因子NXF1。Co-IP和GST pull-down实验证实RBM15与NXF1之间存在相互作用。Western blot结果显示，NXF1在Hemin处理的HT22细胞和ICH小鼠中表达上调，而敲低RBM15可降低NXF1的蛋白表达水平。此外，RIP-PCR和Co-IP实验初步证明m6A阅读蛋白YTHDC1同时与E2F1 mRNA和NXF1相互作用，提示其可能参与E2F1 mRNA的核输出。

下调NXF1减弱Hemin处理的HT22细胞的炎症反应

在HT22细胞中筛选出有效的sh-NXF1序列进行后续实验。ELISA结果显示，敲低NXF1后，抗炎因子IL-10和TGF-β的水平显著升高，而促炎因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平显著降低。这表明敲低NXF1介导的炎症抑制可能对Hemin诱导的HT22细胞损伤发挥保护作用。

下调NXF1减轻ICH小鼠的脑损伤

在ICH小鼠模型中，与假手术组相比，ICH组表现出更大的病变体积、更高的NXF1表达水平、更大的血肿尺寸，以及心率、血压、血糖、脑水含量和mNSS评分的显著增加。此外，细胞死亡增多，炎症因子和神经元特异性烯醇化酶（NSE）水平升高。使用慢病毒敲低NXF1后，与ICH+sh-NC组相比，ICH+sh-NXF1组的NXF1表达下降，病变体积减小，血肿尺寸缩小，心率和血压等生理指标改善，TUNEL阳性细胞数和FJ-C荧光强度显著降低，同时IL-10和TGF-β水平升高，IL-6、IL-1β、TNF-α和NSE水平降低。这些数据表明，下调NXF1对ICH小鼠具有神经保护作用。

敲低NXF1在ICH进展过程中促进线粒体自噬

在体外和体内实验中，ICH条件下均观察到线粒体自噬的参与，表现为LC3在线粒体上的表达增加、线粒体膜电位下降、线粒体ROS水平升高，以及Parkin、PINK1和LC3 II蛋白表达上调。敲低NXF1后，这些线粒体自噬标志物进一步被激活：LC3在线粒体的表达增加、线粒体膜电位增强、线粒体ROS水平降低，且Parkin、PINK1和LC3 II的表达水平升高。这表明敲低NXF1通过激活线粒体自噬来减缓ICH进展。

RBM15通过NXF1调控E2F1 mRNA的核转运

FISH和IF实验显示，E2F1 mRNA主要在细胞核中表达，而NXF1和RBM15在细胞核和细胞质中均有表达。在Hemin处理的HT22细胞中，E2F1 mRNA的核质比降低（即更多出现在胞质）。敲低NXF1后，E2F1 mRNA的核质比升高，胞质中的E2F1 mRNA表达减少。同样，敲低RBM15也显著增加了E2F1 mRNA的核质比，并降低了其在细胞质中的表达。Western blot结果进一步证实了上述发现。这些结果表明，下调RBM15通过调控NXF1介导的E2F1 mRNA核输出来激活线粒体自噬，从而缓解ICH进展。

讨论与结论

本研究在ICH发病机制中发现了一个新的调控轴，涉及RBM15、NXF1和E2F1。数据表明，RBM15正向调控NXF1表达，而下调NXF1通过减轻Hemin处理的HT22细胞的炎症反应和改善ICH小鼠的脑损伤发挥神经保护作用。机制上，敲低NXF1介导的神经保护与线粒体自噬激活相关。此外，研究人员发现RBM15和NXF1协同调控E2F1 mRNA的核转运。研究结论指出，这些发现凸显了RBM15/NXF1/E2F1轴在ICH病理中的关键作用，并提示靶向该轴可能是ICH治疗的一种有前景的策略。

研究也指出了若干局限性。首先，虽然数据表明敲低NXF1显著减轻了炎症反应，且E2F1作为效应因子对NF-κB通路具有调节作用，但其他炎症相关信号通路如MAPK和JAK-STAT是否参与NXF1/E2F1轴介导的炎症反应仍需探索。其次，虽然数据显示RBM15正向调节NXF1表达，但这种效应是通过其m6A甲基转移酶活性还是通过不依赖m6A的机制介导，尚有待确定。第三，E2F1 mRNA核转运的分子机制仍需深入研究。最后，敲低NXF1减少血肿体积的机制尚未解决，可能归因于抑制继发性出血或增强血肿清除。