《Frontiers in Cellular and Infection Microbiology》：Integrated multi-omics analysis and experimental validation identify hub genes with diagnostic value in meningitis
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研究背景：脑膜炎（meningitis）仍然是对人类健康的严重威胁；然而，该疾病的分子机制，尤其是与巨噬细胞参与相关的机制，尚未被完全阐明。本研究旨在鉴定脑膜炎中巨噬细胞相关的核心基因（hub genes），并评估其诊断价值及与免疫细胞浸润的关联。
研究方
研究背景：脑膜炎（meningitis）仍然是对人类健康的严重威胁；然而，该疾病的分子机制，尤其是与巨噬细胞参与相关的机制，尚未被完全阐明。本研究旨在鉴定脑膜炎中巨噬细胞相关的核心基因（hub genes），并评估其诊断价值及与免疫细胞浸润的关联。
研究方法：研究人员分析了来自基因表达综合数据库（Gene Expression Omnibus，GEO）的多个数据集，以鉴定差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）。采用CIBERSORT算法（Cell-type Identification by Estimating Relative Subsets of RNA Transcripts，通过估计RNA转录本相对亚群进行细胞类型鉴定）估算免疫细胞浸润情况。进行加权基因共表达网络分析（Weighted Gene Co-expression Network Analysis，WGCNA），以鉴定与经典活化型（M1）巨噬细胞相关的关键模块。通过整合蛋白质-蛋白质相互作用（protein–protein interaction，PPI）网络与机器学习算法，包括最小绝对收缩和选择算子（least absolute shrinkage and selection operator，LASSO）、支持向量机-递归特征消除（support vector machine–recursive feature elimination，SVM-RFE）和随机森林（random forest）算法，进一步筛选核心基因。采用受试者工作特征（receiver operating characteristic，ROC）曲线并构建列线图（nomogram）评估诊断效能。随后，利用从脑膜炎患者外周血样本中获取的标本，采用逆转录定量聚合酶链反应（reverse transcription quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR）、免疫印迹法（western blotting）和流式细胞术（flow cytometry）进行实验验证。
研究结果：共鉴定出292个差异表达基因，包括195个上调基因和97个下调基因。免疫浸润分析显示，脑膜炎组样本中M1巨噬细胞和活化树突状细胞的比例显著升高。整合WGCNA、PPI网络和机器学习方法的分析鉴定出HBEGF和EREG为核心基因。这两个基因在脑膜炎患者中均显著上调，联合诊断的曲线下面积（area under the curve，AUC）达到0.922。实验验证证实，脑膜炎患者外周血样本中HBEGF和EREG的信使RNA（messenger RNA，mRNA）和蛋白表达水平升高，且M1巨噬细胞比例增加。
研究结论：HBEGF和EREG被鉴定为脑膜炎中与M1巨噬细胞浸润相关的关键基因。这些基因可能作为脑膜炎的潜在诊断生物标志物（diagnostic biomarkers），并为探索未来治疗靶点提供线索。
## 论文解读
### 一、研究背景与意义
脑膜炎（meningitis）是由病原微生物或理化因素引起的软脑膜急性或慢性炎症性疾病，在全球范围内对人类健康构成严重威胁。根据全球疾病负担研究（Global Burden of Disease Study）的数据，2019年全球约有236,000例死亡归因于脑膜炎，约251万例新发病例，疾病负担在低收入和中等收入国家尤为沉重，尤其是非洲脑膜炎带地区，发病率可超过每10万人100例，死亡率超过20%。临床上，脑膜炎常表现为发热、头痛和呕吐，并可能导致听力丧失、智力障碍和运动功能损害等神经系统后遗症，严重影响患者生活质量。
巨噬细胞（macrophages）是免疫系统的重要组成部分，在免疫调节、炎症反应和维持机体稳态中发挥关键作用。在结核性脑膜炎中，巨噬细胞通过表面Toll样受体（Toll-like receptors）识别细菌细胞壁成分，启动宿主免疫应答。已有研究表明，巨噬细胞功能障碍与脑膜炎病情加重和不良预后密切相关。例如，细菌性脑膜炎可激活脑膜伤害感受器，触发降钙素基因相关肽（calcitonin gene-related peptide，CGRP）分泌，CGRP进一步抑制巨噬细胞功能，加剧病情恶化。近年来虽已鉴定出若干免疫相关生物标志物如S100B、胶质纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）和白细胞介素-6（interleukin-6，IL-6），但这些标志物在区分不同病原学类型脑膜炎以及反映潜在免疫调控机制方面仍存在局限性。
因此，鉴定脑膜炎中巨噬细胞相关的核心基因（hub genes）并表征免疫细胞浸润模式，有助于发现潜在治疗靶点，为新型治疗策略的研发提供理论基础。
### 二、研究概述
研究人员采用生物信息学方法整合分析来自GEO数据库的多个数据集（GSE11199、GSE29507、GSE82166、GSE82316及GSE80496），结合免疫浸润分析、加权基因共表达网络分析（WGCNA）、蛋白质-蛋白质相互作用（PPI）网络和三种机器学习算法，鉴定出HBEGF和EREG为脑膜炎中M1巨噬细胞相关的核心基因。随后在新疆医科大学第一附属医院收集的10例脑膜炎患者和10例非脑膜炎神经系统疾病对照者的外周血样本中，通过RT-qPCR、免疫印迹法和流式细胞术进行了表达验证和免疫细胞组成分析。研究结果表明，HBEGF和EREG在脑膜炎患者外周血中显著上调，联合诊断的AUC达到0.922，同时M1巨噬细胞比例显著升高。该研究为脑膜炎的诊断、治疗和预后评估提供了理论支持，也为发现潜在治疗靶点、改善疾病管理提供了线索。
### 三、关键技术方法
研究人员从GEO数据库获取脑膜炎及正常对照样本的原始基因表达数据集，使用R语言affy包进行背景校正和稳健多芯片平均（Robust Multi-array Average，RMA）标准化，采用sva包的ComBat函数校正批次效应。使用limma包以|logFC| ≥ 1且校正后P值 < 0.05为阈值筛选差异表达基因。采用CIBERSORT算法基于LM22参考基因集（1,000次置换）估算22种免疫细胞亚型的相对丰度，并通过Wilcoxon检验比较组间差异。WGCNA分析以软阈值β = 6构建无标度网络，鉴定与M1巨噬细胞显著相关的基因模块。通过STRING数据库构建PPI网络，结合LASSO回归（10折交叉验证选最优λ）、SVM-RFE（径向基核函数）和随机森林（500棵树）三种机器学习算法交叉筛选核心基因。采用pROC包绘制ROC曲线并计算AUC，基于rms包构建列线图和校准曲线评估诊断效能。外部验证使用GSE80496独立数据集。临床验证纳入10例脑膜炎患者和10例非脑膜炎神经系统疾病对照者，采用RT-qPCR检测mRNA表达（2
-ΔΔCt法），免疫印迹法检测蛋白表达，密度梯度离心法分离外周血单个核细胞（peripheral blood mononuclear cells，PBMCs）后以流式细胞术检测M1巨噬细胞比例（标记CD86和iNOS，7-AAD排除非活性细胞）。
### 四、研究结果
**4.1 脑膜炎差异表达基因筛选（Screening of DEGs in meningitis）**
主成分分析（principal component analysis，PCA）显示批次效应校正后PC1解释的变异增至85%，样本按疾病状态清晰分离。以|logFC| ≥ 1且校正后P < 0.05为阈值，共鉴定出292个DEGs，其中上调基因195个，下调基因97个。
**4.2 免疫细胞浸润分析（Immune cell infiltration analysis）**
CIBERSORT分析显示脑膜炎组与对照组在单核细胞、M0巨噬细胞、M1巨噬细胞、M2巨噬细胞、静息树突状细胞、活化树突状细胞、活化肥大细胞和中性粒细胞比例上存在显著差异。脑膜炎组M1巨噬细胞、活化肥大细胞和活化树突状细胞比例升高。免疫细胞相关性分析显示M1巨噬细胞与γδ T细胞呈中度正相关（相关系数 = 0.52）。
**4.3 加权基因共表达网络分析（Weighted gene co-expression network analysis）**
WGCNA鉴定出13个基因模块，其中salmon模块与M1巨噬细胞相关性最强（相关系数 = 0.54，P = 0.02）。该模块内基因显著性（gene significance，GS）与模块隶属度（module membership，MM）呈正相关（相关系数 = 0.49，P = 3 × 10
-7）。将salmon模块基因与DEGs取交集，获得用于后续分析的重叠基因。
**4.4 GO与KEGG富集分析（GO and KEGG enrichment analysis）**
基因本体（Gene Ontology，GO）富集分析显示重叠基因在生物学过程（biological process，BP）中主要富集于体液免疫应答相关过程，在细胞组分（cellular component，CC）中主要富集于质膜外侧，在分子功能（molecular function，MF）中主要富集于磷脂酶结合。京都基因与基因组百科全书（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes，KEGG）通路分析显示基因主要富集于ErbB信号通路、结直肠癌通路、丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activated protein kinase，MAPK）信号通路和磷脂酰肌醇3-激酶-蛋白激酶B（phosphatidylinositol 3-kinase–protein kinase B，PI3K-Akt）信号通路。
**4.5 核心基因鉴定（Identification of hub genes）**
通过STRING数据库构建PPI网络，利用CytoHubba插件基于最大团中心性（Maximal Clique Centrality）算法筛选前10个候选核心基因。经LASSO回归、SVM-RFE和随机森林三种机器学习算法交叉验证，通过Venn图取交集，最终鉴定出HBEGF（heparin-binding EGF-like growth factor，肝素结合性表皮生长因子样生长因子）和EREG（epiregulin，表皮调节素）为脑膜炎中M1巨噬细胞相关的两个核心基因。
**4.6 列线图构建与验证（Construction and validation of the nomogram）**
在训练数据集中，HBEGF（P < 0.05）和EREG（P < 0.001）在脑膜炎组均显著高表达。ROC分析显示HBEGF的AUC为0.759，EREG的AUC为0.893，联合模型AUC达0.922（95%置信区间：0.811–0.989）。基于风险评分公式（Risk Score = 1.57 × HBEGF表达量 + 2.83 × EREG表达量）构建列线图，校准曲线证实模型预测概率与实际观测值具有良好一致性。
**4.7 外部验证与富集分析（External validation and enrichment analysis）**
在GSE80496外部验证数据集中，HBEGF在脑膜炎组显著高表达（P < 0.01），AUC达0.968，EREG虽有高表达趋势但未达统计学显著性。基因集变异分析（Gene Set Variation Analysis，GSVA）显示M1巨噬细胞高表达组主要富集于糖基磷脂酰肌醇（glycosylphosphatidylinositol，GPI）-锚定生物合成、RNA聚合酶和RNA降解通路。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）进一步显示M1巨噬细胞高表达组富集于胞质DNA感知通路、NOD样受体信号通路、RNA降解、RNA聚合酶和Toll样受体信号通路，而低表达组富集于钙信号通路、青少年发病的成人型糖尿病和神经活性配体-受体相互作用通路。
**4.8 核心基因表达实验验证（Experimental validation of hub gene expression）**
RT-qPCR检测结果显示，与对照组相比，脑膜炎患者外周血中HBEGF和EREG的mRNA表达水平均显著上调（P < 0.001）。免疫印迹法检测（每组9例纳入定量分析）证实HBEGF和EREG蛋白表达水平在脑膜炎组均升高，组间差异具有统计学意义（P < 0.05）。
**4.9 外周血M1巨噬细胞比例（Proportion of M1 macrophages in peripheral blood）**
流式细胞术分析显示，脑膜炎患者外周血中M1巨噬细胞比例较对照组显著升高（P < 0.001），与生物信息学分析中CIBERSORT估算的免疫浸润结果一致。
### 五、讨论总结
脑膜炎的致病机制尚未完全阐明，患者常在诊断时已出现严重症状，即使接受治疗预后仍常不理想，因此早期检测和准确诊断成为临床优先事项。既往研究表明IL-6、降钙素原（procalcitonin，PCT）、C反应蛋白（C-reactive protein，CRP）和铁蛋白等可作为细菌性脑膜炎的早期诊断生物标志物，但这些非特异性炎症指标在反映免疫调控机制方面存在局限。本研究鉴定的HBEGF和EREG与M1巨噬细胞极化密切相关，可反映脑膜炎背后的免疫调控机制，具有更高的机制特异性，且联合诊断AUC达0.922，诊断效能优异。
HBEGF是表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）家族成员，以跨膜前体形式合成，可被ADAM金属蛋白酶家族切割生成可溶性形式。HBEGF通过与表皮生长因子受体（epidermal growth factor receptor，EGFR/ERBB1）和ERBB4结合，激活下游MAPK和PI3K-Akt信号通路，调控细胞增殖、迁移、分化和存活。在肿瘤研究中，HBEGF阳性巨噬细胞可通过EGFR依赖机制促进成纤维细胞侵袭。本研究发现HBEGF在脑膜炎患者外周血中表达升高，且伴随M1巨噬细胞显著增加，提示HBEGF可能通过激活EGFR/ErbB信号通路促进M1巨噬细胞极化，从而放大脑膜炎中的炎症反应。
EREG编码表皮调节素，是一种EGF家族的可溶性分泌蛋白。在炎症环境中，表皮调节素通过调节血管生成、血管重塑和细胞增殖参与组织修复和伤口愈合。在牙髓干细胞中，靶向敲低EREG可激活p38 MAPK和细胞外信号调节激酶（extracellular signal-regulated kinase，Erk）通路。本研究中EREG在脑膜炎患者中表达升高，并富集于ErbB、PI3K-Akt和MAPK等炎症相关信号通路，提示EREG表达升高可能通过激活这些下游通路促进炎症的启动和进展。
此外，研究证实脑膜炎患者外周血M1巨噬细胞比例显著升高。在炎症应答中，经典活化型M1巨噬细胞在炎症刺激下释放肿瘤坏死因子-α（tumor necrosis factor-alpha，TNF-α）、IL-1β、IL-12和IL-23等促炎细胞因子，持续激活M1表型可能导致组织损伤。功能性富集分析显示M1巨噬细胞高表达组富集于Toll样受体和NOD样受体信号通路等先天免疫激活通路，进一步支持M1巨噬细胞介导的免疫激活在脑膜炎中的作用。免疫细胞相关性分析揭示M1巨噬细胞与γδ T细胞呈正相关，而γδ T细胞是干扰素-γ（interferon-γ，IFN-γ）的重要来源，IFN-γ信号可促进巨噬细胞向促炎M1表型极化，提示两者之间可能存在免疫学交互作用。
本研究也存在若干局限性：临床验证为小样本单中心队列（脑膜炎组10例，对照组10例），未进行多病原学亚型分层，限制了结果的普适性；采用CIBERSORT基于bulk转录组推断免疫细胞比例，缺乏单细胞数据验证；验证均使用外周血而非脑脊液；数据集缺乏病原体亚组标签，使两个标志物仅反映泛脑膜炎炎症状态，无法区分细菌性与病毒性脑膜炎；且仅获得相关性证据，缺乏细胞和动物实验证明基因对M1极化的因果调控作用。此外，多数脑膜炎患者在采血前已接受经验性抗生素治疗，抗生素干预可能改变外周炎症基因和蛋白表达，构成观察性分析中的混杂因素。
### 六、研究结论
通过整合多组学分析，研究人员鉴定出HBEGF和EREG为脑膜炎中巨噬细胞相关的核心基因，且与M1巨噬细胞浸润密切相关。这些基因可能作为脑膜炎的潜在诊断生物标志物，并为探索未来治疗靶点提供线索。
