《Frontiers in Immunology》：Crotoxin from Crotalus durissus terrificus impairs the establishment of chemically induced colitis in mice associated with formyl peptide receptor signaling
编辑推荐：
### 论文摘要翻译
炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）源于对肠道微生物耐受性的破坏，以过度炎症反应为特征。胃肠道上皮细胞在维持屏障完整性和协调免疫应答中发挥核心作用；然而，上皮功能障碍和失控性炎症的潜在机制仍不完全
### 论文摘要翻译
炎症性肠病（inflammatory bowel disease, IBD）源于对肠道微生物耐受性的破坏，以过度炎症反应为特征。胃肠道上皮细胞在维持屏障完整性和协调免疫应答中发挥核心作用；然而，上皮功能障碍和失控性炎症的潜在机制仍不完全清楚。Crotoxin（CTX）是南美响尾蛇（*Crotalus durissus terrificus*）毒液的主要成分，具有免疫调节活性，是研究肠道炎症中上皮-免疫相互作用的潜在工具。本研究评估了CTX对三硝基苯磺酸（trinitrobenzene sulfonic acid, TNBS）诱导的小鼠急性结肠炎的影响，及其调节人上皮细胞应答的能力。在IFN-γ刺激的Caco-2细胞中，CTX通过维持上皮屏障完整性、保持ZO-1表达、降低ICAM-1表达和IL-8分泌来减弱炎症反应。此外，IFN-γ刺激的Caco-2培养物可诱导中性粒细胞和单核细胞迁移，而CTX的存在可减少该效应。小鼠直肠内滴注TNBS可诱导急性结肠炎，CTX给药可改善该病理过程，表现为体重减轻减少、临床评分降低、坏死面积缩小、固有层中性粒细胞/单核细胞/巨噬细胞募集减少，并部分逆转TNBS诱导的肠道菌群失调。值得注意的是，CTX的保护作用被甲酰肽受体（formyl peptide receptor, FPR）拮抗剂Boc2所消除，表明FPR在CTX效应中发挥作用。总之，CTX通过FPR介导的通路调节上皮和免疫应答并调控肠道菌群，从而阻止急性结肠炎的早期事件，凸显其作为新型治疗候选药物的前景。
### 论文解读文章
**一、研究背景与问题**
炎症性肠病（IBD）是一类以肠道慢性复发性炎症为特征的疾病，主要包括克罗恩病（CD）和溃疡性结肠炎（UC）。IBD的发病机制涉及遗传易感性、肠道菌群失调及黏膜免疫系统耐受性破坏之间的复杂相互作用。肠上皮作为机体抵御病原体入侵的第一道物理屏障，其选择性通透性由跨细胞和旁细胞两条通路介导。其中，旁细胞通路的通透性由顶端连接复合体——包括紧密连接（tight junctions, TJs）和黏附连接（adherence junctions, AJs）——严格调控。当各种遗传或表观遗传因素破坏TJ表达时，可导致上皮屏障功能障碍，进而与肠道菌群失调以及IBD的发生发展密切相关。
在炎症加剧过程中，肠道上皮产生IL-8等介质，募集中性粒细胞并通过吞噬作用和分泌细胞因子/趋化因子加剧白细胞浸润；巨噬细胞也参与这一过程。免疫细胞活化的适当消退对于终止炎症和防止组织损伤至关重要，而该机制失调则构成CD和UC等慢性炎症性疾病的病理基础。尽管生物制剂显著推进了IBD治疗，但仍有大量患者无效或出现不良反应，亟需开发新的干预策略。
在免疫调节剂研究中，响尾蛇毒液因其免疫调节潜力受到关注。Crotoxin（CTX）为南美响尾蛇（*Crotalus durissus terrificus*）毒液的主要成分（约占60%），是由无毒的酸性亚基crotapotin（CA）和具有毒性的碱性磷脂酶A2（phospholipase A2, PLA2）亚基（CB）组成的约24 kDa异二聚体。CA作为分子伴侣引导PLA2至细胞受体，解离后CB发挥酶活性。已有研究表明CTX具有抗炎、免疫调节、抗肿瘤、抗菌和镇痛等活性。鉴于前期研究已证实CTX在TNBS诱导的小鼠急性结肠炎中可减轻临床症状并调节免疫细胞群体，本研究旨在深入探讨CTX调节急性肠道炎症的机制，特别是其对人肠道上皮细胞的直接调节作用及其对免疫细胞迁移的影响。
**二、研究内容与意义概述**
研究人员采用体内和体外相结合的策略，系统研究了CTX对TNBS诱导的急性结肠炎的干预效应及其分子机制。体内实验表明，CTX给药显著改善小鼠体重减轻和临床评分，缩小结肠坏死面积，恢复杯状细胞数量，抑制炎症细胞浸润，降低血清淀粉样蛋白A（SAA）和IL-6水平，并部分逆转TNBS诱导的肠道菌群失调。体外实验显示，CTX直接作用于IFN-γ活化的Caco-2人肠上皮细胞，维持上皮屏障完整性和ZO-1表达，抑制ICAM-1表达和IL-8分泌，进而减少中性粒细胞和单核细胞的迁移。通过FPR拮抗剂Boc2实验证实，CTX的保护作用依赖于甲酰肽受体（FPR）信号通路。该研究揭示了CTX通过FPR介导的“保护上皮屏障-抑制免疫细胞募集-调节肠道菌群”多重机制阻断急性结肠炎早期事件，为IBD治疗提供了新思路。
**三、主要关键技术方法**
本研究采用的主要技术方法包括：（1）动物模型：雄性BALB/c小鼠（7-8周龄，源自巴西布坦坦研究所动物房）经直肠内滴注TNBS（2 mg溶于45%乙醇）诱导急性结肠炎；（2）CTX纯化：通过阴离子交换色谱从*C. d. terrificus*毒液中纯化；（3）体外肠上皮模型：Caco-2人肠上皮细胞分化培养17-18天后，以IFN-γ（40 ng/mL）和/或CTX（250 ng/mL）刺激；（4）跨上皮电阻（TEER）测量和ZO-1免疫荧光共聚焦显微镜分析评估屏障功能；（5）流式细胞术分析小鼠固有层中性粒细胞（Ly6G?CD11b?CD18?）、单核细胞（CD11b?CCR2?）和M1型巨噬细胞（CD11b?MHCII?CD68?）浸润；（6）16S rRNA基因（V3-V4区）高通量测序分析肠道菌群组成（Illumina MiSeq平台，EzBioCloud MTP流程）；（7）FPR拮抗剂Boc2（0.5 mg/kg，腹腔注射）药理学阻断实验。
**四、研究结果**
**4.1 CTX改善急性结肠炎小鼠的临床结局**：在TNBS诱导后12小时给予CTX（0.045 mg/kg，腹腔注射），可显著减轻小鼠体重下降、降低临床疾病评分，并缩小结肠坏死区域。
**4.2 CTX恢复TNBS诱导结肠炎中的杯状细胞**：组织学分析显示TNBS组结肠杯状细胞（PAS阳性）显著减少，而CTX治疗可阻止该损失；同时CTX抑制了TNBS诱导的炎症细胞广泛浸润，组织学炎症评分显著降低。
**4.3 CTX调节Caco-2细胞肠道上皮屏障完整性**：IFN-γ显著降低Caco-2单层TEER并减少ZO-1表达，而CTX可阻止IFN-γ引起的TEER下降和ZO-1下调，表明CTX直接保护肠上皮屏障。
**4.4 CTX调节急性结肠炎小鼠血清淀粉样蛋白A（SAA）产生**：TNBS组小鼠48小时血清SAA水平显著升高，CTX治疗显著降低SAA水平；72小时各组间无显著差异。
**4.5 CTX对急性结肠炎小鼠促炎细胞因子产生的影响**：TNBS组小鼠血清IL-6和TNF-α在所有时间点均显著升高；CTX治疗减弱了这些细胞因子的产生，其中对IL-6的抑制在72小时具有统计学意义。
**4.6 CTX部分逆转TNBS诱导的肠道菌群失调**：16S rRNA测序显示，TNBS组在24小时即出现显著菌群改变——变形菌门（Proteobacteria）相对丰度大幅增加（主要由埃希菌属*Escherichia*扩增驱动），厚壁菌门（Firmicutes）和拟杆菌门（Bacteroidetes）减少；CTX治疗部分逆转了这一失调，降低了Proteobacteria丰度并恢复关键共生菌属。
**4.7 FPR阻断消除CTX在急性结肠炎中的调节作用**：使用FPR拮抗剂Boc2预处理后，CTX对体重减轻和临床评分的改善作用被完全消除，表明CTX效应依赖FPR信号。
**4.8 CTX对黏液产生和结肠上皮的保护作用由FPR介导**：Boc2给药消除了CTX对杯状细胞丢失和组织学损伤的改善作用，证实CTX维持结肠上皮完整性的效应经由FPR通路。
**4.9 FPR阻断消除CTX对免疫细胞募集的调节作用**：CTX显著抑制TNBS诱导的中性粒细胞（Ly6G?CD11b?CD18?）在24-96小时的浸润；在24-72小时抑制单核细胞（CD11b?CCR2?）和M1型巨噬细胞（CD11b?MHCII?CD68?）的募集；Boc2处理完全逆转了这些抑制作用。
**4.10 CTX调节IFN-γ活化Caco-2细胞的ICAM-1表达和IL-8分泌**：IFN-γ显著上调Caco-2细胞ICAM-1表达和IL-8分泌，CTX共同处理显著抑制了这些促炎介质的产生。
**4.11 CTX抑制IFN-γ刺激的肠上皮细胞诱导的人中性粒细胞和单核细胞迁移**：IFN-γ刺激的Caco-2细胞上清液可促进人外周血中性粒细胞和单核细胞迁移，而IFN-γ/CTX组上清液显著减少了这两种细胞的迁移。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，CTX通过双重机制发挥保护作用。一方面，CTX直接作用于肠上皮，通过维持ZO-1表达和TEER保护屏障完整性，抑制IFN-γ诱导的ICAM-1表达和IL-8分泌，从而减少中性粒细胞和单核细胞的募集。另一方面，CTX部分恢复了TNBS诱导的肠道菌群失调，减少Proteobacteria（尤其是*Escherichia*属）的过度扩增。FPR在CTX的免疫调节活性中发挥核心作用：Boc2完全消除了CTX的临床保护、组织学保护和免疫细胞募集抑制作用。已有研究表明CTX的抗炎作用与脂氧素A4（LXA4）经由FPR信号通路有关；本研究进一步将FPR信号确认为CTX在结肠炎模型中保护效应的关键介质。
研究结论为：CTX通过保护肠道屏障完整性阻止促炎细胞募集和组织炎症的建立，其整个保护性级联依赖于FPR通路。TNBS诱导的菌群失调（以Proteobacteria高丰度为特征）产生大量细菌源性甲酰肽，导致FPR过度激活和持续免疫细胞募集。CTX不仅通过FPR通路调节宿主应答，还减少了激活该通路的促炎细菌配体来源，提示CTX具有“调节宿主应答+重塑肠道菌群”的双重作用机制，该研究为将CTX开发为IBD新型治疗策略奠定了基础。
