基于全基因组等位基因频率指纹的全球普通荞麦种质资源遗传特征解析及其农业多样性利用潜力

《Frontiers in Plant Science》：Genetic characterization of a global collection of common buckwheat to harness genetic resources for agricultural diversity

　　

摘要 引言： 被忽视和未充分利用的作物（neglected and underutilized crops, NUCs）具有使农业生态系统和人类饮食多样化的巨大潜力，但需要通过遗传改良使其成为主要作物的经济可行替代品。普通荞麦（Fagopyrum esculentum Moench）因其优异的营养品质、生态重要性以及对作物轮作和土壤健康的益处而备受重视。然而，低而不稳定的产量以及种子成熟不一致等问题限制了该作物在耕作系统中的利用，凸显了对改良品种的需求。遗传资源的可获得性和详细的遗传特征描述是高效育种策略的先决条件。 方法： 本研究阐明了包含170份普通荞麦种质（其中包含9份自交亲和种质和11份有限生长习性种质）的全球种质资源的遗传多样性和系统地理学特征。该种质资源采用双酶切限制性位点相关DNA测序（double digest restriction-site associated DNA sequencing, ddRAD-seq）进行遗传特征解析，以生成种质特异性的全基因组等位基因频率指纹（genome-wide allele frequency fingerprints, GWAFFs）。 结果： 利用基于52,182个基因组位点的准确且可重复的GWAFFs，遗传混合分析揭示了该种质资源内的7个亚群。研究结果表明，在世界特定地区收集的普通荞麦种质通常可追溯至单一亚群。西欧是个例外，因为来自多个不同亚群的种质已被整合到当地的种植和食物系统中。 讨论： 这些发现表明，大多数普通荞麦育种项目仅依赖于现有遗传多样性的一小部分。因此，引入不同来源的遗传材料可以增加许多地方育种项目的遗传多样性。通过GWAFFs对该种质资源进行的精确遗传特征描述，为应用基因组辅助选择等现代育种策略开辟了机遇。该种质资源中81份种质的原种种子已存放于瑞士国家基因库，可供研究、育种和栽培公开获取。

全球普通荞麦种质资源遗传特征解析：从种质保护到现代育种资源转化

一、研究背景与意义

农业机械化在极大提升劳动生产率的同时，也导致了农业系统多样性的下降，少数主要作物日益占据主导地位，而被忽视和未充分利用的作物（NUCs）则逐渐边缘化。这一趋势对生物多样性、生态系统稳定性和人类营养健康产生了负面影响。普通荞麦（Fagopyrum esculentum Moench）作为一种典型的NUC，在欧洲多国具有悠久的栽培历史，19世纪时仍广泛种植，但20世纪初以来逐渐被高产谷物和马铃薯所替代，如今在西欧耕地中已近乎绝迹。重新引入普通荞麦等NUCs被认为是扭转农业生物多样性下降趋势、增强农业生态系统韧性的可行途径。

普通荞麦具有多项值得重新引入的特性：生育期短（3至4个月），对土壤健康有积极影响，是许多作物轮作体系中的有益补充；作为蜜源作物具有生态效益，可减少植保产品的使用；在人类营养方面，它是谷物的无麸质替代品，氨基酸组成优于大多数谷物，且富含有益健康的次生代谢物。此外，普通荞麦在世界各地的区域烹饪传统中具有重要文化价值，如法国的galettes、阿尔卑斯地区的pizzoccheri、东欧的kasha和日本的soba。然而，低而不稳定的产量以及种子成熟不一致等问题限制了该作物在耕作系统中的利用，亟需改良品种来扭转这一趋势。

普通荞麦育种面临经济和技术双重挑战。经济上，有限的种植面积意味着育种投资难以通过品种权使用费获得可观回报。技术上，普通荞麦的自交不亲和性意味着种质是由遗传上不同的个体组成的群体，因此基因分型方法必须基于群体水平的全基因组等位基因频率指纹（GWAFFs）。自交不亲和性和一年生特性还限制了育种只能采用群体育种方法，难以固定优良等位基因，减缓了遗传增益。目前普通荞麦育种项目大多仅依赖现有遗传多样性的一小部分，遗传改良的缺乏使得低产和产量不稳定等农艺缺陷长期未能解决。

本研究旨在提高普通荞麦遗传资源的可获得性和可及性，利用ddRAD测序技术对170份全球来源的普通荞麦种质（ETH Zurich/FOAG种质资源）进行基因组水平的遗传特征解析，探索该种质资源的系统发育结构、起源和多样性，分析亚群间的遗传差异，为未来普通荞麦的研究和育种奠定重要基础。

二、主要关键技术方法

研究人员利用ddRAD测序技术对170份普通荞麦种质进行基因分型。2023年和2024年连续两年在瑞士苏黎世联邦理工学院Eschikon植物研究站田间种植全部种质，每年每份种质随机采集100株植株的叶片，每份种质每年形成1个混合样本。样本送至LGC公司进行DNA提取、文库构建和测序，在Illumina NovaSeq 6000平台进行双端测序。测序读数比对至Tuka基因组装配的单倍体2（Tuka_h2），该参考基因组来自欧洲来源的种质FE213（Devyatka）。利用bcftools进行SNP calling，经质量过滤后获得52,182个高质量SNP用于后续分析。群体遗传结构分析采用NGSadmix软件，遗传多样性指数计算采用grenedalf软件。

三、研究结果

3.1 种子繁殖

经过五年的种子繁殖，共在温室进行了114次繁殖、田间158次、家庭花园15次。最终170份种质成功播种并纳入研究。种质资源覆盖广泛的地理来源，以欧洲和亚洲为主。其中包含9份自交亲和种质和11份有限生长习性种质。81份种质的种子达到足够数量和质量（发芽率高于90%），已存入瑞士国家基因库PGRFA并向公众开放获取。

3.2 测序与SNP calling

ddRAD测序在2023年和2024年平均分别产生770万和700万读段对。比对至Tuka参考基因组的平均比对率为92%。SNP calling初始获得118,172个SNP，经筛选后保留52,182个高质量SNP，分布于全部8条染色体上。PCA分析显示年份间GWAFF数据无显著年份效应，不同年份采集的同一份种质样本在遗传距离上比不同种质间更为接近，证明基因分型结果具有高度一致性。因此后续分析均基于合并两年的测序数据。

3.3 系统发育聚类

ΔK分析强烈支持K=2为最适群体数。K=2时将种质分为两大主要聚类：聚类1主要包含欧洲种质，聚类2主要包含亚洲种质（Fisher精确检验p<0.001）。9份自交亲和种质中有8份归属于聚类2。当K=7时，聚类1分化为以中东欧种质为主的亚群4和两个主要包含西欧种质的亚群2和6。亚群6包含银色种皮种质，亚群2包含棕色和黑色种皮种质。聚类2分化为主要包含日本和韩国种质的亚群1，以及包含中国和尼泊尔种质的亚群3。其余两个亚群包含5份自交亲和种质（亚群5）和来源多样、多来自基因库或植物园的种质（亚群7）。国家层面的分析显示，亚洲和东欧国家的种质通常可追溯至单一祖先亚群，而西欧国家的种质则涉及多个不同亚群，表明西欧经历了反复的种质引入和基因交流。

3.4 多样性分析

种质水平的核苷酸多样性（π）差异很大，范围为0.01至0.33。自交亲和种质的π值普遍较低，其中亚群5（仅含自交亲和种质）的π值仅为0.12，远低于其他亚群（0.30至0.33）。育种项目相关种质的π值约为0.31，仅Kade Research Ltd.项目因依赖自交亲和种质而较低（0.26）。温室繁殖的种质平均π值（0.28）略低于田间繁殖或未繁殖种质（0.29）。Theta Watterson值在各亚群间变化范围较窄（0.10至0.14），Tajima's D大体遵循核苷酸多样性的模式。

3.5 高度分化基因组区域

K=2的F_ST分析发现7个F_ST>0.6的SNP，其中4个位于5号染色体末端100 bp区域内。K=7的成对比较中，排除亚群5后共发现162个F_ST>0.75的SNP，合并邻近SNP后鉴定出52个高度分化基因组区域。这些区域附近注释到与开花时间和光周期相关的基因（如FRIGIDA）、生长素运输调控基因（PIN-likes）和Ca²⁺信号相关基因（谷氨酸受体类似物）等。

四、讨论与结论

4.1 普通荞麦的系统发育聚类：西欧的多样化起源

研究结果揭示了普通荞麦的系统地理学特征：欧洲和亚洲的种质明显分化，90%的欧洲种质归属于主聚类1，而所有亚洲种质可追溯至聚类2。亚洲内部，北亚（日本和韩国）与喜马拉雅地区（中国和尼泊尔）之间存在强烈的遗传分化。普通荞麦的假定起源中心位于中国南方，向东北亚和欧洲的多次迁移事件中可能仅携带了部分遗传多样性，奠基者效应和随后的地理隔离及遗传漂变导致了地理上明确的亚群形成。高F_ST值主要出现在欧洲与亚洲亚群之间的比较中，高度分化区域附近存在与开花时间和花发育相关的基因，暗示不同气候区域的环境适应。与亚洲和东欧不同，西欧的种质可追溯至多个亚群，且许多种质具有混合来源，这与通过贸易路线和农民种子交换导致的反复引入和持续基因交流一致。瑞士的案例说明，不同亚群对应的种皮颜色、脱壳难易度和面粉品质等表型特征与区域烹饪传统和消费偏好密切相关，如"苏格兰荞麦"（银色种皮）和"西里西亚荞麦"（深色种皮）的区分反映了东西方种质和烹饪传统对瑞士的双重影响。

4.2 普通荞麦育种的多样性来源

异花授粉作物的原种繁殖是保持种质特性和确保遗传资源可持续利用的关键步骤。研究结果表明，尽管仅使用单层网隔离，不同来源种质间的遗传差异在繁殖过程中得以保持，说明种质内授粉占主导地位。温室繁殖（可作为初始种子量少的代理指标）仅导致核苷酸多样性轻微下降0.01，表明初始种子量足以保持大部分多样性。研究还发现，来自俄罗斯Orel育种项目的种质（FE104、FE237、FE144、FE090）代表了亚群4的大部分遗传多样性，东欧大多数种质（包括所有有限生长习性种质）似乎源自该育种项目。日本NARO育种项目的新品种与日本传统遗传资源密切相关，加拿大的自交亲和种质可追溯至日本和韩国种质。这些发现表明，不同系统地理区域间的种质交换可以丰富地方育种项目。值得注意的是，整个种质资源的核苷酸多样性仅略高于亚洲两个亚群，育种项目中的多样性水平与亚群相当，说明普通荞麦的育种努力并未导致严重遗传瓶颈，这与其以异交为主的交配系统密切相关。

4.3 从种质特征描述到前沿育种

本研究建立的遗传资源为普通荞麦现代育种策略提供了重要支撑：结合基因型信息与多环境表型评估，可通过全基因组关联分析鉴定控制农艺性状的基因组区域；建立基因组预测和选择的训练群体；为构建核心种质提供合理依据；为泛基因组研究奠定基础。通过GWAFFs的精确遗传特征描述，ETH Zurich/FOAG普通荞麦种质资源已从保存资源转变为有价值的育种资源，可为增加农业多样性作出贡献。

结论： 本研究通过对170份全球来源的普通荞麦种质进行ddRAD测序和GWAFFs分析，揭示了该物种的遗传多样性和系统地理学结构。研究发现普通荞麦种质可分为两大主聚类和七个亚群，亚洲和东欧的种质通常可追溯至单一亚群，而西欧则汇集了多个亚群的遗传资源。大多数育种项目仅利用了可用遗传多样性的一小部分，引入不同来源的遗传材料可丰富地方育种项目的遗传基础。研究建立的精确遗传特征描述为基因组辅助选择等现代育种策略的应用开辟了机遇，81份种质的原种种子已存放于瑞士国家基因库，可供研究、育种和栽培公开获取，为普通荞麦的遗传改良和农业多样性增加奠定了重要资源基础。