基于阳离子聚合物稳定dsRNA的口服RNAi技术在大豆褐蝽（Euschistus heros）中的基因沉默效果评估

《Neotropical Entomology》：Oral RNAi in Euschistus heros: Evaluation of Gene Silencing Using Cationic Polymer-Stabilized dsRNA

　　

摘要专业翻译 大豆褐蝽（Euschistus heros）是新热带地区大豆的关键害虫，对可持续农业生产构成了日益严峻的挑战。鉴于对更具靶向性和环境安全防控策略的迫切需求，RNA干扰（RNA interference, RNAi）技术作为一种创新工具应运而生。本研究探讨了以V-ATPase和act两个参与细胞基础生理过程的关键基因为靶标的RNAi基因沉默潜力。研究人员通过显微注射双链RNA（double-stranded RNA, dsRNA），评估了E. heros成虫和若虫阶段对RNAi的敏感性，并检测了唾液和血淋巴中核酸酶对dsRNA的离体（ex-vivo）降解活性。此外，还研究了一种基于dsRNA与阳离子聚合物偶联的口服递送策略。显微注射dsRNA表现出高敏感性，尤其在未成熟个体中效果显著，并诱导了强烈的基因沉默效应，同时伴随死亡率升高。唾液中检测到强烈的核酸水解活性，凸显了dsRNA保护性载体开发的必要性。口服暴露于偶联dsRNA可有效保护分子免受酶促降解，并对昆虫存活率和基因表达产生显著影响。上述发现凸显了E. heros对显微注射dsRNA递送方式的高度敏感性，同时强调了RNAi策略在开发定制化生物杀虫剂方面的巨大潜力，也表明需进一步优化递送策略，以充分实现其在农业害虫管理中的实际应用价值。

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一、研究背景与研究目的

大豆褐蝽（Euschistus heros）属半翅目（Hemiptera）蝽科（Pentatomidae），是一种多食性害虫，寄主范围广泛，可危害棉花、玉米和大豆等重要作物。该虫广泛分布于拉丁美洲及巴西南部、阿根廷、巴拉圭、乌拉圭、玻利维亚和巴拿马等地，被认为是南美洲最重要的农业害虫之一。在缺乏栽培作物的情况下，E. heros可在杂草和树木上存活，这些植物充当其天然庇护所。该害虫通过取食豆荚和籽粒造成直接危害，消耗光合产物并注入淀粉酶等酶类，从而降低籽粒品质和重量。尽管生物防治、农艺措施和抗性品种利用等多种策略可用于E. heros的治理，化学防治仍是最广泛采用的手段。然而，化学农药的过度使用对环境和人类健康造成不利影响，并已导致E. heros产生抗药性。

RNA干扰（RNAi）是一种由双链RNA（dsRNA）触发的保守生物学机制。在昆虫细胞质中，Dicer核酸酶将dsRNA加工为18–24 bp的小干扰RNA（small interfering RNA, siRNA），后者被整合入RNA诱导沉默复合体（RNA-induced silencing complex, RISC），由Argonaute亚基引导至互补RNA序列并对其进行切割，从而实现靶基因沉默。前期转录组分析已在E. heros中鉴定出RNAi相关基因的同源物，表明该昆虫具备功能性RNAi机制。显微注射靶向必需基因的dsRNA可导致E. heros若虫和成虫高死亡率，即使在极低剂量下亦然，并伴随繁殖力下降和发育缺陷等亚致死表型。然而，口服递送dsRNA的效率远低于显微注射，这主要归因于昆虫唾液和肠道中核酸酶对dsRNA的快速降解。因此，开发有效的dsRNA保护与递送策略，是推动RNAi技术田间应用的关键瓶颈。

本研究旨在评估阳离子聚合物——聚（2-氨基乙基甲基丙烯酸酯）（poly(2-aminoethylmethacrylate), pAEMA）——通过口服途径递送靶向V-ATPase基因的dsRNA时，能否提高E. heros成虫和若虫的RNAi敏感性。研究首先评估了唾液和血淋巴对dsRNA的酶促降解能力，进而考察dsRNA与阳离子聚合物复合后对降解的抵抗效果。

二、主要关键技术方法

研究人员采用多种关键技术手段开展研究。供试E. heros虫源来自野外采集种群，分别在巴西联邦大学佩洛塔斯分校和比利时根特大学分子昆虫学实验室饲养。主要技术方法包括：①dsRNA合成与显微注射：以V-ATPase亚基A和act（肌动蛋白）基因为靶标，通过体外转录合成dsRNA，分别对成虫（注射剂量15–40 ng/mg）和三龄若虫（28 ng/mg）进行显微注射；②离体降解实验：收集成虫唾液和血淋巴，将裸露dsRNA及聚合物复合dsRNA与唾液或血淋巴共孵育，在不同时间点取样进行琼脂糖凝胶电泳分析；③阳离子聚合物复合物制备：采用自由基聚合法合成pAEMA，以2:1聚合物与dsRNA比例形成聚电解质复合物（polyplex）；④口服暴露实验：以改良D3人工饲料为载体，将裸露或复合dsRNA（500 ng/mg饲料）掺入饲料中饲喂三龄若虫，监测死亡率与基因表达变化；⑤RT-qPCR基因表达分析：以RPL32和RNA18S为内参基因，采用2^?ΔΔCt法评估靶基因及RNAi通路核心基因（Ago2、Dicer2）的表达水平。

三、研究结果

3.1 Euschistus heros对RNAi的敏感性

显微注射靶向V-ATPase基因的dsRNA在所有测试浓度下均对E. heros成虫和若虫的存活率产生显著影响（p < 0.001），且呈剂量依赖性反应。成虫在注射后第二天开始出现渐进性死亡，最高剂量（40 ng/mg）在第7天死亡率超过75%。若虫在第三天出现急剧存活率下降，dsact处理组的死亡进程快于dsV-ATPase处理组，但实验结束时两组存活率均低于5%。基因表达分析显示，显微注射dsV-ATPase后4小时即可检测到基因沉默效应，96小时时转录水平降低77%–95%。值得注意的是，最高剂量处理组在注射后4–24小时内未观察到基因沉默，随后在48和96小时才出现显著抑制，提示高剂量dsRNA可能触发早期应激或代偿性调控机制。

若虫显微注射后出现多种致死表型，包括蜕皮失败（被困于前一龄期旧角质层中）、运动协调障碍、嗜睡、肿胀、血淋巴渗漏及取食停止等。成虫未检测到解剖学变化，但观察到嗜睡和不规则运动。

3.2 裸露dsRNA与dsRNA复合物的离体降解

将裸露dsRNA与E. heros唾液共孵育后，30分钟即出现显著降解，60分钟后仅剩微弱条带，2小时后仅可见低分子量降解片段。相比之下，与阳离子聚合物形成复合物的dsRNA在唾液暴露后大部分可被完整回收，即使在唾液中孵育72小时仍保持稳定性。在血淋巴中，180分钟内未观察到dsRNA降解，裸露和复合dsRNA均保持完整。在无核酸酶水中，两种形式的dsRNA在180分钟内均完全稳定。

3.3 口服暴露dsRNA

三龄若虫取食添加裸露或复合dsRNA的半液态人工饲料后，各处理间取食量无显著差异（one-way ANOVA，F = 2.351，p = 0.0679）。死亡率范围为20%–56%，其中取食未偶联聚合物的处理死亡率最高（56%），其次为dsV-ATPase复合物（47%）和dsact复合物（40%）。对照组和裸露dsRNA处理组死亡率均低于35%。Kaplan–Meier生存分析显示各饲料处理间无显著差异（p = 0.06），但配对比较表明取食豆荚的对照组存活率显著高于取食dsV-ATPase和dsact复合物的处理组。

基因表达分析显示，取食dsact饲料的昆虫第3天act基因表达下降，第6天有所回升但仍比dsgfp对照组低20%；而取食dsact与聚合物复合物的昆虫在两个采样时间点act表达均升高，最高达对照组的180%。取食dsV-ATPase饲料及dsV-ATPase复合物饲料的昆虫，V-ATPase基因表达较dsgfp对照降低38%–60%，差异具有统计学意义，但dsgfp加聚合物对照组也观察到类似降低。Dicer基因表达在第3天各处理均显著高于水对照，第6天回落至对照水平。Ago基因表达模式在各处理间存在差异，dsact处理组两个时间点均呈低表达，而dsact加聚合物处理组表达最高。

四、讨论与结论

研究表明，E. heros对显微注射dsRNA表现出极高的敏感性，即使在比既往研究低40%的剂量下仍能诱导显著死亡率。若虫阶段比成虫对RNAi更为敏感，三龄若虫注射dsV-ATPase后第8天死亡率达95%，第9天达100%；注射dsact后第8天死亡率即达100%，优于此前报道的二龄若虫效果。V-ATPase基因沉默导致的蜕皮失败表型与其在角质层代谢中的关键作用一致。唾液是dsRNA口服递送的主要屏障，其核酸酶可在30分钟内显著降解裸露dsRNA；而血淋巴中未检测到明显核酸酶活性，这与显微注射途径的高效性相吻合。阳离子聚合物pAEMA复合可有效保护dsRNA免受唾液核酸酶降解，在72小时内维持分子完整性。口服实验中，复合物处理虽表现出一定的死亡率升高趋势，但总体效果有限，且聚合物本身也表现出一定的毒性效应。基因表达数据提示，口服dsRNA可诱导一定程度的靶基因沉默，但RNAi通路核心基因（Ago、Dicer）的表达变化模式复杂，可能与dsRNA剂量、递送效率和个体差异有关。

综合而言，E. heros对RNAi具有高度敏感性，显微注射是评估基因功能和筛选RNAi靶标的有效工具。口服递送dsRNA的效率受限于唾液核酸酶的快速降解，阳离子聚合物复合策略可有效保护dsRNA并部分改善口服RNAi效果，但需进一步优化递送载体和配方，以实现RNAi生物杀虫剂在E. heros田间防控中的实际应用。未来研究应关注递送系统的生物相容性、靶标基因的优化选择以及跨世代效应评估。