《Discover Immunity》：In silico design of a multi-epitope mRNA vaccine candidate against rift valley fever virus using integrative immunoinformatics approaches
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裂谷热病毒（Rift Valley fever virus, RVFV）是一种重要的人畜共患病原体，可在人类和家畜中引起严重疫情，目前尚无已获批的有效疫苗。本研究采用反向疫苗学（reverse vaccinology）和免疫信息学（immunoinformat
裂谷热病毒（Rift Valley fever virus, RVFV）是一种重要的人畜共患病原体，可在人类和家畜中引起严重疫情，目前尚无已获批的有效疫苗。本研究采用反向疫苗学（reverse vaccinology）和免疫信息学（immunoinformatics）方法，设计了三种针对RVFV的多表位mRNA疫苗候选物。研究人员从关键病毒蛋白的保守抗原区域中鉴定出细胞毒性T淋巴细胞（cytotoxic T-lymphocyte, CTL）、辅助性T淋巴细胞（helper T-lymphocyte, HTL）和线性B细胞（linear B-cell, LBL）表位。所选表位通过适当的连接子（linker）和人β-防御素1（Human Beta Defensin 1）佐剂组装成三种疫苗构建体。所有三种构建体均被预测具有高抗原性（得分0.5075–0.5467）、非致敏性和非毒性。它们表现出良好的理化性质、高溶解性和优异的结构稳定性，Ramachandran图中超过93%的残基位于允许区域。分子对接（molecular docking）显示其与Toll样受体TLR-2和TLR-3具有强结合亲和力，而分子动力学模拟（molecular dynamics simulations）证实了疫苗-受体复合物的稳定性。免疫模拟预测可激活强大的先天性和适应性免疫应答，包括显著的B细胞和T细胞增殖及细胞因子产生。密码子优化产生了高密码子适应指数（Codon Adaptation Index, CAI）值（0.9–1.0）和最佳的GC含量（50.9–55.2%），表明具有高效表达的强大潜力。这些发现表明，所设计的多表位mRNA疫苗构建体具有有利的预测抗原性、理化性质、结构及受体结合特性。然而，所有结果均仅来源于计算分析，应视为初步结果。这些构建体需要经过严格的体外（in vitro）和体内（in vivo）验证，以确认抗原表达、免疫激活、安全性、免疫原性及针对RVFV的保护效力，之后才能被视为可行的疫苗候选物。
裂谷热病毒mRNA疫苗计算机模拟设计研究解读
一、研究背景与意义
裂谷热病毒（Rift Valley fever virus, RVFV）是一种重要的人畜共患病原体，属于白蛉病毒属（Phlebovirus），归类于布尼亚病毒目（Bunyavirales）表病毒科（Phenuiviridae）。该病毒自1931年在肯尼亚首次被发现以来，已在撒哈拉以南非洲、埃及、也门和沙特阿拉伯等地反复引发大规模疫情，造成大量家畜死亡、严重的经济损失以及超过千人的死亡病例。RVFV主要通过伊蚊（Aedes）和库蚊（Culex）叮咬传播，但人类感染多数源于与感染动物的血液、器官或组织直接接触。
在家畜中，RVFV感染以新生动物高死亡率、流产风暴和幼畜先天性畸形为特征；在人类中，虽有1–2%的感染者会发展为严重疾病，包括肝炎、视网膜炎、脑炎和出血性表现，但在重大疫情期间住院患者病死率可达50%。RVFV基因组由小（S）、中（M）、大（L）三个单链RNA片段组成，S片段编码核蛋白（N）和非结构蛋白NSs，M片段编码NSm及糖蛋白前体Gn和Gc，L片段编码RNA依赖性RNA聚合酶。
近年来，气候变化促进了媒介蚊虫向新生态区的扩散，RVFV的地理分布持续扩大。2022至2024年间，东非和西非多个国家报告了持续传播和反复暴发。全球牲畜贸易和人口流动进一步引发了对RVFV传入欧洲和北美等既往未受影响地区的担忧。尽管疾病负担重大，目前尚无获批的RVFV抗病毒疗法，现有疫苗在效力和安全性方面仍有限。虽然NDBR-103、TSI-GSD-200和MP-12等候选疫苗已进入人体试验阶段，但均未获得完全监管批准。此外，现有家畜疫苗缺乏区分感染与疫苗接种动物（DIVA）的能力，部分减毒活疫苗还存在致畸效应和器官病理等安全性问题。
鉴于现有疫苗策略的局限性以及RVFV持续构成的公共卫生威胁，开发改进的疫苗设计方法具有迫切需求。多表位mRNA疫苗平台作为下一代策略展现出广阔前景，其利用反向疫苗学和免疫信息学方法鉴定病毒蛋白质组中的保守且免疫优势表位，指导宿主细胞产生特异性抗原肽而不引入感染性物质，从而提高安全性并缩短生产时间。
二、研究内容与主要结论
研究人员采用全面的计算机模拟疫苗学流程，设计针对RVFV的多表位mRNA疫苗。研究从NCBI数据库检索了1,476条RVFV蛋白序列，经抗原性和免疫原性评估后筛选出130条序列，进一步通过多序列比对（multiple sequence alignment）获得23个保守蛋白。利用NetMHCpan 4.1和NetCTL v1.2预测CTL表位，NetMHCIIpan 4.0和IEDB服务器预测HTL表位，ABCPred和Bepipred预测线性B细胞表位。所有候选表位均经过抗原性、致敏性、毒性及细胞因子诱导能力评估，并通过BLASTp同源性分析排除与人蛋白的交叉反应性。
最终共选择63个表位设计三种mRNA疫苗构建体，每种构建体包含8个线性B细胞表位、8个CTL表位和5个HTL表位。疫苗框架整合了5′帽、5′非翻译区（UTR）、Kozak序列、组织型纤溶酶原激活剂（tPA）信号肽以及人β-防御素1（HBD1）佐剂，采用EAAAK、GPGPG、KK和AAY等连接子连接各组分，并添加3′UTR和poly(A)尾以增强mRNA稳定性和翻译效率。
三、关键技术方法
本研究采用的主要技术方法包括：从NCBI数据库检索RVFV蛋白序列；利用VaxiJen 2.0和VaxiJen 3.0评估抗原性和免疫原性；使用MEGA 12的MUSCLE算法进行多序列比对；采用NetMHCpan 4.1、NetCTL v1.2、NetMHCIIpan 4.0、IEDB、ABCPred和Bepipred等服务器预测各类表位；通过IFNepitope、IL6pred和IL10pred评估细胞因子诱导能力；使用BLASTp进行交叉反应性分析；利用AlphaFold 3预测三级结构并经GalaxyRefine优化；通过ClusPro进行分子对接；使用iMODS进行分子动力学模拟；采用C-ImmSim进行免疫模拟；利用JCAT进行密码子优化并在SnapGene中完成虚拟克隆。
四、研究结果
抗原性、致敏性与毒性预测： 三种疫苗构建体的抗原性得分分别为0.5075、0.5161和0.5467，均超过VaxiJen服务器默认阈值0.4，且均被预测为非致敏性和非毒性。
人群覆盖率分析： IEDB人群覆盖率工具分析显示，构建体1、2、3的全球预测覆盖率分别为95.94%、94.71%和90.52%。构建体1在各大洲表现出最高且最一致的覆盖率，其中欧洲达98.54%，北美94.92%，西非91.90%。
理化性质预测： 三种构建体的分子量分别为138,651.73 Da、139,315.10 Da和139,493.39 Da，理论等电点（pI）为9.05–9.24，呈碱性特征。不稳定指数为36.99–39.85，均低于40阈值，确认构建体稳定性良好。脂肪指数（75.40–77.55）表明具有良好的热稳定性，GRAVY值（?0.399至?0.456）反映其亲水性。溶解度预测显示三种构建体均可溶。
二级与三级结构： SOPMA预测显示构建体主要呈球状构象，具有良好的柔韧性和稳定性。AlphaFold 3预测的三级结构经GalaxyRefine优化后，Ramachandran图分析显示构建体1、2、3分别有95.9%、94.4%和93.1%的残基位于允许区域，表明预测结构在立体化学上是可靠的。
构象B细胞表位： ElliPro分析在三种构建体中各鉴定出5个构象B细胞表位，得分范围0.669–0.85，精确定位了三维结构中的抗原决定簇。
分子对接与动力学模拟： ClusPro对接显示三种构建体与TLR-2和TLR-3均表现出强且稳定的相互作用。iMODS分子动力学模拟中，与TLR-2相互作用的特征值范围为3.33×10??至9.78×10??，与TLR-3的为1.09×10??至1.67×10??，低特征值表明结构易于变形且复合物稳定。
免疫模拟： C-ImmSim结果显示单剂量疫苗即可有效刺激树突状细胞、巨噬细胞和上皮细胞，并在最初几天内激活CD4?辅助T细胞、CD8?细胞毒性T淋巴细胞和自然杀伤（NK）细胞，同时激活B淋巴细胞和浆细胞，表明疫苗具有引发全面免疫应答的潜力。
密码子优化与克隆： JCAT优化产生高CAI值（0.9–1.0）和最佳GC含量（50.9–55.2%），表明在大肠杆菌K-12中具有高效表达潜力。虚拟克隆成功将优化序列插入pET-28a(+)表达载体。
五、讨论与结论
RVF作为一种重要的新兴病毒性人畜共患病，具有高死亡率和不断扩大的地理分布范围。本研究中设计的三种多表位mRNA疫苗构建体在计算机模拟层面均表现出良好的抗原性、安全性、结构稳定性和免疫激活潜力。其中构建体1在全球人群覆盖率方面表现最优。所有结果均来源于计算分析，应视为初步结果。这些构建体需要经过严格的体外（in vitro）和体内（in vivo）验证，以确认抗原表达、免疫激活、安全性、免疫原性及针对RVFV的保护效力，之后才能被视为可行的疫苗候选物。
