《Frontiers in Immunology》：Sodium butyrate ameliorates intestinal motility and is associated with enteric neuroimmune changes in slow transit constipation mice
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背景：慢传输型便秘（slow transit constipation, STC）的发病机制尚未完全阐明，目前尚无相关特异性药物可供临床使用。因此，本研究联合16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA, 16S rRNA）基因测序、非靶向代谢组学、
背景：慢传输型便秘（slow transit constipation, STC）的发病机制尚未完全阐明，目前尚无相关特异性药物可供临床使用。因此，本研究联合16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA, 16S rRNA）基因测序、非靶向代谢组学、转录组学分析以及小鼠干预模型，以表征与STC相关的改变并评估丁酸钠（sodium butyrate, NaB）的作用。方法：对人源样本进行16S rRNA基因测序、非靶向代谢组学和RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）。建立洛哌丁胺诱导的STC小鼠模型以评价NaB的作用。采用苏木精-伊红（hematoxylin–eosin, H&E）染色、阿尔新蓝（Alcian blue）染色和免疫组织化学（immunohistochemistry, IHC）评估结肠组织，同时利用纵行肌-肌间神经丛（longitudinal muscle and myenteric plexus, LMMP）制备物进行免疫荧光和定量逆转录聚合酶链反应（quantitative reverse transcription PCR, qRT-PCR）分析。结果：STC患者与健康供体之间存在16个差异细菌属。非靶向代谢组学鉴定出71个满足变量投影重要性（variable importance in projection, VIP）> 1且名义p < 0.05的探索性候选代谢物。共鉴定出2,825个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs）。对独立的代谢组学和转录组学数据集进行通路水平比较，发现丁酸代谢（butanoate metabolism）是探索性重叠通路之一。在体内实验中，研究人员发现NaB改善了STC小鼠的粪便参数。NaB处理伴随肠神经系统（enteric nervous system, ENS）微环境中CD206相关巨噬细胞信号的增加和促炎细胞因子表达的降低。NaB处理后，HuC/D阳性神经元数量增加，共表达cleaved caspase-3的HuC/D阳性神经元数量减少。此外，NaB处理后共表达pSTAT3的HuC/D阳性神经元数量减少。结论：NaB改善了洛哌丁胺诱导的STC小鼠的便秘相关表型，并伴随ENS中炎症特征的减少、肌间神经元凋亡的降低以及神经元pSTAT3染色的减少。这些发现提示，NaB的有益作用可能与肠神经免疫微环境的调节有关。
**研究背景与意义**
功能性便秘（functional constipation, FC）是一种常见的胃肠道（gastrointestinal, GI）疾病，主要表现为排便频率减少、粪便干硬和排便不尽感，对患者的工作和生活造成严重负面影响。随着饮食结构和生活方式的改变，FC的发病率逐年上升。研究证实，与无便秘个体相比，便秘患者的全因死亡率增加12%，罹患冠心病和缺血性卒中的风险分别增加11%和19%。慢传输型便秘（slow transit constipation, STC）是FC的常见亚型，以结肠传输时间（colonic transit time, CTT）延长和排便频率降低为特征。目前，STC的发病机制仍不完全清楚，临床上尚无特异性治疗药物可供使用。
近年来，越来越多的研究表明肠道微生物群在调节肠道运动中发挥重要作用。在无菌小鼠中，肠神经系统（enteric nervous system, ENS）表现出与肠道运动障碍相关的显著结构和功能缺陷；恢复肠道微生物群后，不仅ENS缺陷得以修复，肠道运动也显著改善。肠道微生物群可通过肌层巨噬细胞（muscularis macrophages, MMs）上调骨形态发生蛋白2（bone morphogenetic protein 2, BMP2）的表达，从而促进肌间神经元发育并改善肠道运动。STC患者已被观察到存在肠道菌群失调，结肠肌间神经元也存在异常，但总体而言，关于STC肠道菌群失调的研究仍然较少。
代谢物是肠道微生物群与宿主相互作用中的一类重要信号分子。微生物群来源的代谢物如对甲酚和苯乙酰谷氨酰胺与CTT呈强正相关，而短链脂肪酸中的丁酸（butyrate）据报道可调节肠道运动，并对ENS的早期发育和神经肌肉传递有促进作用。因此，代谢物的改变可能在STC的发生发展中发挥重要作用。此外，RNA测序（RNA sequencing, RNA-seq）已被广泛用于探索多种疾病的分子发病机制，微生物群的变化可导致肠道组织基因的差异表达，而代谢物同样与基因差异表达相关。
基于以上背景，本研究联合16S核糖体RNA（16S ribosomal RNA, 16S rRNA）基因测序、非靶向代谢组学和RNA-seq，系统表征STC相关的肠道微生物群、代谢物和基因表达变化。通过对独立的代谢组学和转录组学数据集进行通路水平比较，鉴定候选通路。基于探索性发现的汇聚性证据以及丁酸与肠道功能已知的生物学关联，研究人员进一步在洛哌丁胺诱导的STC小鼠模型中评估了丁酸钠（sodium butyrate, NaB）的作用。该研究为理解STC的发病机制及NaB的潜在治疗价值提供了新的多组学证据。
**关键技术方法**
本研究采用人源样本与动物模型相结合的策略。人源粪便样本来自14例STC患者和12例健康供体，进行16S rRNA基因测序和非靶向代谢组学分析；人源结肠组织来自4例接受全结肠或次全结肠切除术的STC患者和3例结肠癌手术患者的癌旁正常组织（距肿瘤边缘>5 cm），进行RNA-seq分析。动物实验采用30只8周龄雄性C57BL/6j小鼠，随机分为对照组（CON组）、洛哌丁胺诱导的STC组和NaB处理组（每组10只）。STC组和NaB组给予洛哌丁胺10 mg/kg灌胃，每日两次，连续12天；第6至12天NaB组在饮用水中添加1.1% NaB。采用印度墨汁灌胃法评估肠道传输时间，ELISA法检测血清胃动素（motilin, MTL）和肽YY（peptide YY, PYY）水平。结肠组织采用H&E染色、阿尔新蓝染色和免疫组织化学（靶标：F4/80和CD206）评估。制备纵行肌-肌间神经丛（LMMP）进行免疫荧光染色（PGP9.5/CD206、HuC/D/cleaved caspase-3、HuC/D/pSTAT3）和qRT-PCR检测（炎症因子及凋亡相关基因）。生物信息学分析采用edgeR、clusterProfiler、LEfSe和PICRUSt等工具。
**主要研究结果**
**STC患者肠道微生物群特征**
16S rRNA基因测序共鉴定出975个操作分类单元（operational taxonomic units, OTUs），其中STC组866个、对照组748个，两组共有639个。α-多样性指数（Chao1、Good's coverage、observed species、Shannon）在两组间无显著差异。主坐标分析（principal coordinates analysis, PCoA）显示两组微生物群落分布存在部分视觉差异，但置换多元方差分析（PERMANOVA）未发现整体群落组成存在统计学显著差异。在门水平上，STC组梭杆菌门（Fusobacteriota）相对丰度显著降低。在属水平上，经错误发现率（false discovery rate, FDR）校正后，两组间存在16个差异菌属。其中，与丁酸产生相关的菌属——Lachnospiraceae_UCG-010、Lachnospiraceae_UCG-004、Lachnospiraceae_NK4A136_group以及Butyricicoccus在STC患者中的相对丰度均显著降低。PICRUSt功能预测显示，生物素代谢和脂多糖生物合成两条预测代谢通路在两组间存在差异。
**STC患者粪便代谢组谱的探索性特征**
正交偏最小二乘判别分析（orthogonal partial least squares discriminant analysis, OPLS-DA）显示STC患者与健康对照的代谢组谱存在探索性分离，模型参数为R2X = 0.337、R2Y = 0.992、Q2 = 0.183。共71个代谢物满足VIP > 1且名义p < 0.05的探索性标准，但经Benjamini-Hochberg多重检验校正后无一保持统计显著性（FDR < 0.05），因此这些代谢物被视为探索性候选代谢物。KEGG通路富集分析显示，经多重通路检验校正后仅维生素消化与吸收通路保持统计学显著（FDR < 0.05），丁酸代谢在该分析中有所体现但未达到校正后显著性水平。曲线下面积（area under the curve, AUC）> 0.850的5个候选区分代谢物为：2-(1-甲基丙基)-4,6-二硝基苯酚、argpyrimidine、LysoPE (0:0/18:3)、赖氨酰亮氨酸和2,6-二甲基吡嗪。
**STC患者与癌旁对照结肠组织的差异基因表达分析**
RNA-seq的主成分分析（principal component analysis, PCA）显示两组基因组成存在差异。以|log
2 fold change| > 1且FDR < 0.05为标准，共鉴定出2,825个差异表达基因（differentially expressed genes, DEGs），其中1,460个上调、1,365个下调。基因本体论（Gene Ontology, GO）富集分析显示，DEGs主要参与肌肉系统过程、肌肉收缩等生物过程，细胞黏附分子结合、肌动蛋白结合等分子功能，以及黏着连接和肌动蛋白细胞骨架等细胞组分。KEGG通路分析表明DEGs主要涉及黏着斑和蛋白质消化与吸收信号通路。丁酸代谢在含有DEGs的通路中也有所体现。通路水平重叠分析显示，丁酸代谢和酪氨酸代谢是代谢组学和转录组学数据集中含相对较多差异代谢物和DEGs的共同通路。
**NaB对粪便参数、结肠组织学结构和胃肠激素的影响**
与CON组相比，STC组小鼠首粒黑便排出时间显著延长；NaB处理后，首粒黑便排出时间显著缩短，粪便粒数显著增加，粪便含水量和粪便重量均较STC组有所改善。血清MTL水平在NaB组较STC组显著升高，而血清PYY水平显著降低。H&E染色显示STC小鼠存在组织学改变，NaB处理后黏膜形态定性改善、炎症细胞浸润减少。阿尔新蓝染色显示STC小鼠黏蛋白相关染色减少，NaB处理后增加。
**NaB处理伴随ENS微环境中炎症标志物减少和CD206相关信号改变**
IHC分析显示，三组间F4/80
+巨噬细胞数量在黏膜下层和肌层中，CON组与STC组无显著差异，但NaB组较STC组显著减少。CD206
+巨噬细胞数量在STC组较CON组显著减少，而NaB组较STC组在黏膜下层和肌层均显著增加。LMMP中qRT-PCR检测显示，STC小鼠促炎细胞因子IL-1β和IL-6的mRNA表达水平显著升高，NaB处理后显著降低；TNF-α在三组间无显著差异；IL-10的mRNA表达在NaB组较STC组升高。PGP9.5/CD206双重免疫荧光显示，STC组PGP9.5荧光强度较CON组显著降低，NaB组显著升高；CD206荧光强度在STC组较CON组显著降低，NaB处理后显著增加。
**NaB处理伴随肌间神经元凋亡减少**
STC组HuC/D阳性神经元数量较CON组显著减少（p < 0.01），NaB处理后较STC组增加。STC组共表达cleaved caspase-3的HuC/D阳性神经元数量显著增加，NaB处理后较STC组显著减少。qRT-PCR结果显示，NaB组Bcl2的mRNA表达上调，Bax表达下调，caspase-3表达较STC组显著降低。
**NaB处理伴随STC小鼠神经元STAT3活化减少**
STC组共表达pSTAT3的HuC/D阳性神经元数量较CON组显著增加，NaB组共表达pSTAT3的HuC/D阳性神经元数量较STC组显著减少。
**讨论与结论**
本研究通过16S rRNA测序发现STC患者与健康供体间α-多样性无显著差异，提示STC肠道菌群失调的机制仍需进一步研究。属水平上，多个产丁酸菌属（Lachnospiraceae_UCG-010、Lachnospiraceae_UCG-004、Lachnospiraceae_NK4A136_group及Butyricicoccus）在STC患者中相对丰度显著降低，提示丁酸产生菌减少可能与STC相关。代谢组学层面，维生素消化与吸收通路是经FDR校正后唯一显著的差异通路，涉及的B族维生素对神经递质合成和神经元膜合成至关重要，其缺乏可能导致与结肠慢传输相关的肠神经元可塑性改变。丁酸代谢虽在代谢组学通路分析中未达到校正后显著性水平，但综合产丁酸菌减少、代谢通路改变、转录组-代谢组重叠以及丁酸在肠道运动和ENS调节中的已知生物学作用等多方面汇聚性证据，被选为后续功能验证的候选通路。
动物实验证实NaB可改善洛哌丁胺诱导的STC小鼠的便秘表型。NaB处理伴随CD206相关巨噬细胞信号增强和促炎因子表达降低，提示NaB可能影响ENS微环境中的免疫状态。肌间神经元方面，NaB处理使神经元数量增加、凋亡标志物减少，且伴随神经元pSTAT3染色降低，表明NaB的有益作用可能与减少ENS中IL-6/STAT3相关信号活性有关。然而，当前证据尚不足以确立IL-6/STAT3通路在NaB效应中的直接因果作用，需通过IL-6刺激、STAT3激动剂/抑制剂或挽救实验等进一步验证。
本研究存在若干局限性：动物实验缺乏阳性药物对照；人类队列样本量较小；粪便微生物组/代谢组与结肠转录组数据来自独立队列，无法进行个体水平的多组学关联分析；转录组对照采用癌旁组织而非真正健康结肠组织；代谢组学层面无单个代谢物通过FDR校正，丁酸代谢在代谢组通路分析中未达到FDR校正显著性，且未直接定量粪便丁酸水平，丁酸相关发现应被视为探索性和假设生成性的；未前瞻性记录每日饮水量；未进行巨噬细胞耗竭/极化操作或直接IL-6/STAT3干预实验，限制了对所观察到的神经免疫变化的因果推断。
**研究结论**：本研究确定了STC患者中若干丁酸相关菌属（如Lachnospiraceae_UCG-010、Lachnospiraceae_UCG-004、Lachnospiraceae_NK4A136_group和Butyricicoccus）的相对丰度降低。对独立的代谢组学和转录组学数据集进行通路水平比较，发现丁酸代谢为一个探索性候选通路。在洛哌丁胺诱导的STC小鼠中，NaB处理改善了便秘相关表型和肠道运动功能。这些改善伴随CD206相关巨噬细胞信号的改变、促炎细胞因子表达的降低、神经元凋亡的减少以及神经元pSTAT3染色的减少。这些发现提示NaB的有益作用可能与ENS微环境的改变有关，但巨噬细胞相关变化和IL-6/STAT3信号通路的因果作用仍需进一步研究。
