《Frontiers in Neuroscience》：A pH-responsive and self-healing CEC/PEG-(CHO)2 hydrogel for controlled neuropeptide S delivery and endogenous neural repair after spinal cord injury
编辑推荐：
研究人员设计了一种pH响应型CEC/PEG-(CHO)?水凝胶支架，用于局部递送神经肽S（Neuropeptide S, NPS），以调控脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）后的恶劣微环境。该支架在模拟损伤部位的酸性条件下表现出加速降解
研究人员设计了一种pH响应型CEC/PEG-(CHO)?水凝胶支架，用于局部递送神经肽S（Neuropeptide S, NPS），以调控脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）后的恶劣微环境。该支架在模拟损伤部位的酸性条件下表现出加速降解的特性，从而实现对NPS的可控释放。其多孔微观结构（孔径50?150 μm）和压缩弹性模量（0.081 MPa，略低于天然脊髓的柔软度）提供了有利于神经元存活和分化的力学微环境。在T11完全横断小鼠模型中，负载NPS的支架显著减轻了局部炎症（降低MMP-9、TNF-α、CD68；升高IL-10）、抑制胶质瘢痕形成、募集内源性Nestin?神经干细胞/前体细胞（Neural Stem/Progenitor Cells, NSPCs），并促进其分化为成熟的MAP2?神经元，伴随髓鞘形成增强（MBP?）和突触整合增强（SYP?/MAP2?）。这些效应通过NPS-NPSR轴及其下游Ca2?/cAMP信号通路介导。本研究表明，合理设计的pH响应型水凝胶能够有效重塑SCI微环境并激活内源性神经修复机制，为SCI治疗提供了一种有前景的策略。
**论文解读**
**一、研究背景与科学问题**
脊髓损伤（Spinal Cord Injury, SCI）全球约有2700万患者，每年新增约18万例，由于中枢神经系统再生能力极为有限，患者常遗留永久性神经功能缺损。SCI后的病理级联反应表现为一个恶劣的微环境，其特征包括酸化、剧烈炎症、氧化应激以及胶质瘢痕形成，这些因素共同阻碍内源性修复过程。应对这些病理特征需要能够动态响应损伤微环境的治疗系统，以实现靶向干预。在此背景下，pH响应型水凝胶和自愈合水凝胶作为可时空控释治疗因子的递送平台而备受关注。其中，席夫碱键（Schiff base linkages）因其在酸性条件下可逆水解、反应条件温和、动力学快且生物相容性良好，成为同时赋予水凝胶pH响应性和自愈合性能的理想化学键选择。然而，CEC/PEG-(CHO)?水凝胶此前主要应用于非神经领域（如肝细胞癌治疗和骨软骨缺损修复），在中枢神经系统修复，尤其是SCI中的应用尚属空白。
在生物活性分子选择方面，神经肽作为神经修复的多功能调节剂日益受到关注。其中，神经肽S（Neuropeptide S, NPS）是一种由20个氨基酸组成的多肽，能同时激活Gq和Gs信号通路，引发细胞内钙动员（Ca2? mobilization）和cAMP积累，这些过程对神经可塑性和存活至关重要。NPS在阿尔茨海默病模型中增强突触可塑性并减少Aβ病理，在帕金森病中减轻氧化应激并保护多巴胺能神经元，在神经病理性疼痛中抑制小胶质细胞和星形胶质细胞活化，但其在SCI修复中的潜力尚未被探索。因此，研究人员将NPS首次应用于完全性脊髓横断小鼠模型，探索其通过NPS-NPSR轴介导内源性神经修复的可能性。
**二、主要技术方法**
研究人员通过Michael加成反应将壳聚糖（chitosan）修饰为N-羧乙基壳聚糖（N-carboxyethyl chitosan, CEC），使其在中性pH条件下具有良好的水溶性；随后将CEC与双苯甲醛封端的聚乙二醇（dibenzaldehyde-terminated poly(ethylene glycol), PEG-(CHO)?）在水溶液中通过席夫碱反应交联，制备CEC/PEG-(CHO)?水凝胶。材料表征采用了傅里叶变换红外光谱（FTIR）确认席夫碱键的形成，扫描电子显微镜（SEM）观察多孔微观结构，单轴压缩测试评估力学性能。体外释放实验采用小鼠NPS ELISA试剂盒测定NPS释放曲线。细胞实验方面，NSPCs从胚胎第15天（E15）C57BL/6小鼠端脑新鲜分离，经神经球培养后用于分化和轴突生长实验；利用RT-qPCR分析神经元分化相关转录因子表达。动物实验采用雌性C57BL/6小鼠（6–8周龄）建立T11完全横断SCI模型，设对照组、支架组、游离NPS组、功能支架组和NPSR-KO组（NPSR1基因敲除小鼠接受功能支架），每组15只。采用BMS（Basso Mouse Scale）开放场地评分和皮层运动诱发电位（Cortical Motor Evoked Potentials, CMEPs）评估运动功能恢复，结合免疫组织化学、Fluo-4钙离子探针染色等方法揭示机制。
**三、研究结果**
**3.1 NPS负载CEC/PEG-(CHO)?水凝胶支架的制备与表征**
CEC与PEG-(CHO)?通过动态席夫碱键交联形成水凝胶，FTIR谱图中1644 cm?1处出现席夫碱特征吸收峰，证实交联成功。单轴压缩测试显示水凝胶的压缩弹性模量为0.081 MPa，略低于天然脊髓。支架在28天内逐渐降解，溶胀动力学适合脊髓植入。SEM显示多孔微观结构（孔径50?150 μm）。NPS释放呈现快速模式：约80%在10小时内释放，24小时完成释放。水凝胶还表现出优异的可注射性和自愈合能力——不同染色的凝胶块在2.5小时内愈合成整体，且可抵抗重力保持完整。AO/PI染色和CCK-8实验证实支架和NPS对NSPCs无明显细胞毒性。研究人员指出，NPS的快速释放由扩散主导，旨在匹配SCI后72小时内达到高峰的急性炎症窗口期，而支架本体的持续质量保留则为神经再生提供长期结构支撑。
**3.2 小鼠NSPCs表型鉴定及NPS体外促神经发生效应**
从E15小鼠端脑分离的NSPCs在增殖培养基中形成神经球，89.5%表达Nestin、91.1%表达PAX6、89.9%表达SOX2，证实为均质的NSPCs群体。分化实验中，25 ng/mL和100 ng/mL NPS处理7天后TUJ1?未成熟神经元比例分别升至51.3%和39.8%，而对照组仅为18.6%；500 ng/mL NPS则抑制分化（降至1.5%），提示存在剂量窗效应。14天后，25 ng/mL和100 ng/mL NPS组MAP2?成熟神经元比例分别达36.4%和37.5%，显著高于对照组（12.3%）。qPCR分析显示NPS上调DAB1、PPFIA2、KCNJ10、LRRK2、DHH和POU3F2等转录因子，提示NPS促进突触形成、髓鞘化和功能性神经元发育。轴突生长实验中，200 ng/mL和500 ng/mL NPS使GAP43?轴突长度从对照组的3.2 μm分别增至12.5 μm和13.3 μm，并上调PLXNA4、CAPN-1和Sema3A等轴突相关基因。
**3.3 功能支架对SCI后微环境的调控作用**
在T11完全横断小鼠模型中，功能支架组在术后3天使MMP-9?面积降至16.4%，显著低于支架组（27.5%）和游离NPS组（34.4%），而对照组为42.6%。同时，功能支架组显著降低TNF-α?细胞比例（16.6% vs. 对照组53.6%）和CD68?活化小胶质细胞/巨噬细胞比例（33.8% vs. 对照组75.3%），并使抗炎因子IL-10?细胞比例升高至31.8%（对照组9.4%）。术后6周，功能支架组CSPGs沉积（平均荧光强度27.8）显著低于对照组（47.7）。这些效应在NPSR-KO小鼠中均消失，证实依赖NPS-NPSR信号轴。
**3.4 功能支架通过募集内源性NSPCs增强神经发生和髓鞘形成**
术后7天，功能支架组Nestin? NSPCs比例（21.2%）显著高于支架组（13.7%）和游离NPS组（8.4%），TUJ1?神经元比例（29.0%）也最高。术后6周，功能支架组MAP2?成熟神经元密度（71.5%）远超对照组（32.3%）、支架组（48.2%）和游离NPS组（42.9%）；MBP荧光强度（57.7）亦显著高于其他治疗组，表明髓鞘形成增强。SYP?/MAP2?突触共定位分析显示功能支架组83.0%的成熟神经元形成突触前结构，提示功能性神经回路整合。NPSR-KO组各项指标均处于低水平。Nissl染色证实6周时支架已完全降解，且损伤核心区细胞浸润增加、空腔形成减少。膜片钳记录进一步显示功能支架组神经元动作电位发放频率显著高于支架组和NPS组。
**3.5 功能支架通过NPSR介导的Ca2?/cAMP信号通路改善运动恢复**
BMS评分显示，术后3至5周功能支架组评分显著优于对照组和NPSR-KO组；术后6周功能支架组平均BMS评分达6.93，表现为频繁或持续的足底踏步及协调的爪部放置，而对照组、支架组和游离NPS组分别为3.62、5.28和4.98。CMEPs检测中功能支架组振幅最大（2.49 mV），显著高于支架组（1.12 mV）和游离NPS组（1.40 mV）。Fluo-4钙离子探针显示功能支架组细胞内Ca2?水平（26.4%）显著升高，cAMP免疫荧光强度（193.9）亦为各组最高。这种Ca2?/cAMP双通路激活与NPSR同时偶联Gq和Gs蛋白的特性一致，进而通过Ca2?-CaMKIV和cAMP-PKA通路磷酸化CREB，上调再生相关基因并促进轴突再生。H&E染色显示各组主要器官（心、肝、脾、肾）未见明显病理改变，证实该系统具有良好的体内生物相容性。
**四、总结与结论**
本研究将负载NPS的CEC/PEG-(CHO)?水凝胶支架植入T11完全横断脊髓损伤小鼠体内，有效改善了抑制性微环境。通过激活NPS受体NPSR及其下游Ca2?和cAMP信号通路，功能支架将内源性NSPCs募集至损伤区域，促进其分化为功能性神经元，并支持轴突再生，进而实现神经回路的部分重建和后肢运动功能的显著改善。综上，这些结果表明NPS功能化支架代表了一种有前景的SCI修复转化治疗策略。
