《Frontiers in Microbiology》：Detection and genomic characterization of West Nile virus lineage 2 in captive harbor seals in southern Italy
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**摘要**
引言：西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）是一种蚊媒黄病毒（flavivirus），维持在鸟-蚊传播循环中，偶发溢出事件可导致人类和动物的神经侵袭性疾病。本研究描述了两例WNV谱系2型（lineage 2）感染致死病例，发生于意
**摘要**
引言：西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）是一种蚊媒黄病毒（flavivirus），维持在鸟-蚊传播循环中，偶发溢出事件可导致人类和动物的神经侵袭性疾病。本研究描述了两例WNV谱系2型（lineage 2）感染致死病例，发生于意大利南部某动物园圈养的斑海豹（*Phoca vitulina*）中，同时对检测到的病毒株进行了基因组特征分析和系统发育分析。
方法：采用多重实时荧光定量反转录聚合酶链反应（real-time RT-PCR）对斑海豹样本进行WNV谱系1型和谱系2型的同时检测。对选定的提取物进一步采用微滴式数字PCR（droplet digital PCR，ddPCR）进行分析。研究人员进行了二代测序（next-generation sequencing，NGS），并对获得的序列进行了系统发育分析。在死亡斑海豹围栏附近使用美国疾病控制与预防中心（CDC）诱蚊灯进行针对性蚊虫采集，并对雌蚊进行了WNV筛查。对其中一只海豹还进行了组织病理学检查。
结果：在两只海豹的中枢神经系统组织以及围栏附近采集的一批雌性尖音库蚊（*Culex pipiens*）中均检测到WNV谱系2型RNA。近乎完整的WNV基因组与意大利南部的当代病毒株聚为一簇，与当地病毒循环一致。
讨论：这些发现记录了与致死性神经系统疾病相关的斑海豹WNV谱系2型感染，拓展了目前对该病毒宿主范围的认识，并提供了互补的原位昆虫学和基因组学证据。总体而言，本研究凸显了在动物园中采用综合"同一健康"（One Health）监测方法的价值。
**论文解读**
**一、研究背景与问题提出**
西尼罗病毒（West Nile virus，WNV）是一种有包膜的单股正链RNA虫媒病毒，属于黄病毒科（Flaviviridae）。该病毒主要通过野生鸟类和库蚊属（*Culex*）蚊虫之间的地方性动物病传播循环维持，而人类和其他脊椎动物通常作为偶然的终末宿主（dead-end hosts）。在已确认的WNV谱系中，谱系1型和谱系2型与人类和动物的临床疾病关联最为密切。自谱系2型传入欧洲以来，该谱系已在许多地区逐步取代谱系1型，目前是欧洲报告的大多数人类和动物病例的主要病原。过去十年间，WNV已在包括意大利在内的多个欧洲国家牢固扎根，季节性暴发被定期记录。在欧洲，尖音库蚊（*Culex pipiens*）被认为是维持传播的主要媒介。WNV感染的临床表现范围从无症状或轻度发热性疾病到严重的神经侵袭性疾病，包括脑膜炎、脑炎和急性弛缓性麻痹。
尽管鸟类仍是主要的扩增宿主，但WNV已在广泛的哺乳动物物种中被检测到，凸显了该病毒在野生动物-媒介界面的生态复杂性。然而，有关海洋哺乳动物WNV感染的报道仍极为罕见，此前仅有一例北美港海豹（*Phoca vitulina*）的致死性病例记录。这些观察结果表明，WNV生态学的若干方面仍不完全清楚，尤其是关于非典型宿主及其可能促成当地传播动态的条件。在此背景下，开展本项研究具有重要的科学意义和公共卫生价值。
**二、研究内容与意义**
本研究描述了意大利南部坎帕尼亚大区那不勒斯某动物园内两只圈养斑海豹的WNV谱系2型感染，并呈现了一项整合了动物诊断、蚊虫监测和基因组特征分析的综合"同一健康"（One Health）调查。这是欧洲范围内首次在斑海豹中检测到WNV，更重要的是，这是首次通过同期原位昆虫学监测为感染事件提供病毒循环背景证据的报告。
**三、关键技术方法概述**
研究人员采用多重实时荧光定量反转录聚合酶链反应（real-time RT-PCR）对WNV谱系1型和2型进行同时检测，阳性样本由国家外来动物疫病参考中心（CESME）进行确认。选定的阳性样本进一步通过微滴式数字PCR（ddPCR）进行绝对病毒定量分析。对具有足够病毒信号的RNA提取物进行二代测序（NGS），在Illumina MiSeq平台上运行。新生成的基因组与从公共数据库获取的524条代表性WNV谱系2型序列一并进行系统发育分析，采用MAFFT进行序列比对，使用IQ-TREE推断最大似然系统发育树，并在BEAST中进行时间尺度重建。蚊虫采集使用CDC诱蚊灯在斑海豹围栏附近进行过夜收集，蚊虫经形态学鉴定后按分类群处理，仅对雌蚊进行分子检测。对其中一只海豹（Seal 2）进行了组织病理学检查，包括大脑、脊髓、膀胱、心脏、肺和小肠等代表性样本的苏木精-伊红（H&E）染色和全玻片数字化扫描。
**四、主要研究结果**
**（一）临床病程与实验室诊断**
Seal 1（3岁雄性）于2025年7月底出现午后厌食，次日出现脊柱后凸（kyphosis），随后临床表现迅速恶化，表现为吸气性啰音以及尾鳍和右胸鳍麻痹导致的游泳能力受损。尽管接受了恩诺沙星（enrofloxacin）、非甾体抗炎药和维生素B补充治疗，该海豹在发病第4天出现严重神经系统表现，包括精神沉郁、角弓反张（opisthotonos）、颈项强直（nuchal rigidity）和呼吸窘迫。第6天出现近乎完全的躯干瘫痪、持续性角弓反张和眼球震颤（nystagmus），最终实施安乐死。大体病理学检查提示与潜在感染过程相关的心搏骤停，随后在脑组织（循环阈值Ct值：30.8）、心脏（Ct：32）和脾脏（Ct：33）中检测到WNV谱系2型RNA。
Seal 2（2岁雄性）在Seal 1死亡后不久出现轻度厌食，经维生素B补充支持治疗后3天内临床症状完全缓解。2025年8月中旬采集的血清样本经病毒中和试验（VNT）检测显示WNV特异性抗体滴度为1:160。尽管初期症状缓解，该海豹于9月中旬开始出现进行性体重下降，随后厌食复发并伴有快速临床恶化，出现与Seal 1一致的神经系统表现，次日自然死亡。脑组织（Ct：34）和脊髓（Ct：36）检测为WNV谱系2型阳性。
**（二）病毒定量与基因组特征**
ddPCR定量分析显示，Seal 1脑组织病毒载量为4.55拷贝/μL（277个阳性微滴），心脏为5.25拷贝/μL（89个阳性微滴）；Seal 2脑组织为3.85拷贝/μL（460个阳性微滴），脊髓为1.7拷贝/μL（21个阳性微滴）。二代测序从海豹组织和WNV阳性蚊虫池中获得了近乎完整的WNV基因组。比较基因组学分析在来自海豹的基因组中鉴定出同义替换和错义替换，氨基酸变化主要集中在非结构蛋白（NS1、NS2A、NS3、NS4B和NS5）中，且脑源性与脾源性序列之间存在若干差异，提示宿主内和/或组织相关的变异。
**（三）昆虫学调查**
在Seal 1确诊WNV感染后开展的昆虫学调查中，共采集到3只白纹伊蚊（*Aedes albopictus*）和21只尖音库蚊（*Culex pipiens*）雌蚊。实时PCR检测在尖音库蚊雌蚊中检出WNV谱系2型，支持了海豹围栏附近存在感染媒介的判断。
**（四）系统发育分析**
系统发育分析确认所有序列均属于谱系2型，并与2024–2025年传播季节在意大利南部检测到的病毒株聚为一簇，符合当地传播的特征。蚊虫池、Seal 1和Seal 2来源的基因组之间的高度同源性，结合宿主与媒介基因组的一致性，为这一非典型溢出事件中感染的当地获得性提供了连贯的证据支持。
**（五）组织病理学发现**
Seal 2的组织病理学检查显示，软脑膜、大脑灰质和脊髓受到轻度、慢性、多灶性血管周围淋巴浆细胞性脊髓灰质脑炎（lymphoplasmacytic polioencephalomyelitis）的影响。炎症浸润由中等数量的小淋巴细胞、少量浆细胞和罕见的活化巨噬细胞组成。在中脑和额叶灰质内观察到小多灶性胶质细胞增生（gliosis）和小胶质细胞增殖，偶见噬神经元现象（neuronophagia）。此外，左心室心外膜检测到类似的淋巴细胞性血管周围套袖（perivascular cuffing），伴轻度多灶性间质性心肌炎和局灶性心肌细胞坏死，肺间质间隔和血管周围间隙也存在轻度类似炎症改变。这些发现与病毒性神经侵袭性疾病相符。
**（六）同一园区其他动物检测**
在同一2025年传播季节内，该动物园提交的24具其他动物尸体均检测为WNV和USUV阴性，涉及黇鹿（*Dama dama*）、灰雁（*Anser anser*）、环颈雉（*Phasianus colchicus*）、大红鹳（*Phoenicopterus roseus*）等18个物种。此外，10匹共处同一地点的马匹经血清学检测抗WNV IgM抗体均为阴性。
**五、讨论与结论**
本研究首次在欧洲斑海豹中记录了WNV谱系2型感染，并通过同期昆虫学监测为感染事件提供了病毒当地循环的直接证据。动物园作为多种脊椎动物共存的环境，为媒介活动、野生动物储存宿主和易感圈养宿主的交互提供了独特的生态界面。尽管园区内存在大量潜在易感动物且同期检测均为阴性，临床显性感染仅在斑海豹中被发现，这一现象提示非典型宿主可能揭示局灶性传播或宿主特异性易感性，而非不同动物物种间的广泛传播。
从诊断角度来看，两只海豹的病毒学和免疫学特征存在差异。Seal 1脑组织Ct值较低且RNA在多个器官中被检出，提示更广泛的组织播散；Seal 2在血清中同时存在WNV特异性IgG抗体和脑、脊髓组织中可检测的病毒RNA，提示感染可能发生在血清转化之后，或处于体液免疫发展与组织中病毒RNA持续可检测之间的短暂重叠期。基因组分析进一步揭示了脑源性与脾源性序列之间的差异，提示可能存在宿主内异质性或组织相关的区室化（compartmentalization），但鉴于病例数量有限且缺乏功能性实验验证，这些模式应谨慎解读。
研究结论为：这些发现拓展了WNV谱系2型在欧洲的已知宿主范围，强调了在媒介活动季节加强对野生动物虫媒病毒认知的必要性。动物园可作为当地媒介和野生动物中病毒扩增的早期预警系统，基因组特征分析可将哨兵事件与更广泛的区域传播动态联系起来，为动物和人类群体的风险评估提供支持。
从实践角度，这些发现支持在WNV流行季节对动物园实施针对性预防措施，包括加强围栏周围媒介控制、消除蚊虫孳生地、开展常规昆虫学监测、对突发死亡或神经系统疾病进行及时病毒学调查，以及对共处易感物种进行主动监测。未来研究应聚焦于共处物种的系统性血清学筛查、纵向媒介采样以及跨组织和跨宿主的扩展基因组分析，以更好地确定WNV感染在圈养条件下海洋哺乳动物中的发生频率和流行病学意义。
