基于单核RNA测序解析外侧下丘脑性别相关的昼夜节律信号特征

《Frontiers in Sleep》：Sex-associated circadian signaling signatures in the lateral hypothalamus

　　

引言：外侧下丘脑（lateral hypothalamus, LH）是协调觉醒、摄食、代谢、应激反应和睡眠-觉醒状态转换的中枢整合枢纽。这些功能在24小时周期内并非一成不变，而是根据昼夜节律时相和内部生理状态被动态门控。尽管在与LH功能相关的许多稳态和行为领域已记录到性别差异，但在确定的LH神经元群体中，这些差异背后的分子底物仍知之甚少。方法：本研究采用单核RNA测序（single-nucleus RNA sequencing, snRNA-seq），检查了来自雌性和雄性LH神经元、经转录组解析的群体中核心时钟基因和昼夜节律信号相关通路的表达模式。结果：虽然LH的总体细胞结构在两性之间高度保守，但研究人员鉴定出与内在昼夜节律调节及对经典昼夜节律神经调质通路敏感性相关的基因存在广泛分布且细胞类型特异性的差异，这些通路包括血管活性肠肽（vasoactive intestinal peptide, VIP）、精氨酸加压素（arginine vasopressin, AVP）、神经介素（neuromedin）信号和褪黑素受体。这些差异见于谷氨酸能、GABA能、食欲素（orexin）能和黑色素浓集激素（melanin-concentrating hormone, MCH）相关神经元群体，提示雌性和雄性LH环路在保持共同细胞组织的同时，可能差异性地整合时间信息与生理信息。讨论：研究人员的发现并非支持存在性别特异性神经元类别，而是支持一种模型，即雌性和雄性来源的LH神经元之间微小但协调的分子信号结构变化与性别相关。这些数据为理解竞争性稳态驱动的时间调控如何因性别而异提供了框架，并强调在 hypothalamic 回路的转录组分析中将性别作为生物学变量纳入考量的重要性。

**解读文章**

**研究背景与科学问题**：昼夜节律由视交叉上核（suprachiasmatic nucleus, SCN）这一主时钟驱动，并通过神经和体液输出，经背内侧下丘脑（dorsomedial hypothalamus, DMH）等次级振荡器形成分布式的调控网络。外侧下丘脑（lateral hypothalamus, LH）是整合觉醒、摄食、代谢、体温调节、应激反应和睡眠-觉醒转换的关键中枢，接收来自SCN和DMH的投射，并表达多种与昼夜节律调控相关的神经调质受体及核心时钟基因。既往研究已观察到LH相关功能存在性别差异，但这些差异在特定LH神经元群体中的分子基础仍不清楚。核心问题是：LH内的性别差异究竟反映为本质上不同的神经元类别，还是在共享环路中通过分布式分子调控产生？为此，研究人员利用snRNA-seq系统比较了雌性和雄性LH神经元中核心时钟基因和昼夜节律信号相关通路的表达特征。

**研究内容与主要结论**：研究人员取成年雌性（n=4）和雄性（n=4）Vgat-IRES-cre小鼠，在暗期开始（ZT12）这一生物学相关时间点双侧微分离LH组织，进行单核RNA测序。经过质控、去双联、批次整合和LH神经元富集后，共获得33,235个高质量LH神经元核（雌性16,432个；雄性16,803个），两性核数比值比值比（odds ratio, OR）为1.0。无监督聚类共鉴定出24个细胞簇，雌性和雄性来源的细胞在所有簇中均有分布，未发现性别特异性的细胞簇，提示LH总体细胞组织在两性间高度保守。针对预先定义的时钟和昼夜节律信号相关基因（genes of interest, GOIs），研究人员发现共有15个基因存在显著性别差异表达（FDR校正p<0.05）：雌性来源的LH神经元富集Avpr1a、Mtnr1b、Per2、Per3、Nr1d1、Nr1d2和Rora；雄性来源的LH神经元富集Vipr2、Nmur2、Cckar、Rorb、Per1、Cry1、Clock和Npas2。

**主要技术方法**：研究采用10x Genomics Chromium GEM-X Single Cell 3′ v4平台在AVITI系统上进行snRNA-seq。数据处理使用SoupX去除环境RNA，DoubletFinder去除双联体，Seurat进行过滤和归一化，Harmony进行批次效应整合；聚类和可视化采用主成分分析（PCA）、Leiden算法和均匀流形近似投影（UMAP）。差异表达分析采用Wilcoxon秩和检验，并以Benjamini–Hochberg法控制错误发现率（false discovery rate, FDR）。样本来源于美国加州大学戴维斯分校，所有操作经机构动物护理与使用委员会批准。

**结果一：单核RNA测序与LH神经元图谱**。通过整合雌性和雄性数据并进行无监督聚类，研究人员获得24个LH神经元簇；根据GABA（Slc32a1、Gad1、Gad2）、谷氨酸（Slc17a6）、orexin（Hcrt）和MCH（Pmch）标志基因进行神经化学表型注释，共鉴定出12个GABA能簇、10个谷氨酸能簇、1个orexin能簇和1个MCH相关簇。各神经元类型的比例在两性间接近，OR值介于0.85–1.20之间，进一步支持LH细胞组成在两性间高度相似。

**结果二：谷氨酸能和GABA能神经元中的性别差异**。在谷氨酸能LH神经元中，雌性来源的核富集Per2、Nr1d2、Rora和Avpr1a；雄性来源的核富集Vipr2、Cckar、Nmur2、Npas2和Clock。在GABA能LH神经元中，雌性来源的核富集Nr1d2、Per2、Per3、Rora和Mtnr1a；雄性来源的核富集Nmur2、Rorb、Vipr2、Per1、Cry1、Arntl和Clock。这些结果提示，谷氨酸能和GABA能LH神经元可能通过特定突触后受体类型表现出对AVP、VIP、胆囊收缩素（cholecystokinin, CCK）、神经介素S（neuromedin-S, NMS）和褪黑素等经典昼夜节律神经调质通路的性别相关敏感性。

**结果三：orexin和MCH肽能神经元中的性别差异**。在orexin能神经元中，雌性来源的核富集Npas2，雄性来源的核富集Nr1d2；Avpr1b和Avpr2在orexin与MCH神经元中均未检出，Mtnr1a在orexin神经元中缺失，Vipr1和Avpr1a在MCH神经元中缺失。在MCH相关神经元中，雄性来源的核富集Rora、Cry1、Arntl、Npas2和Mtnr1a，雌性来源的核未发现显著差异表达基因。这表明LH肽能神经元在暗期开始时，其核心时钟及辅助反馈调节因子的表达也存在性别差异。

**结果四：性激素受体表达**。所有LH神经元类型均表达雄激素受体（androgen receptor, Ar）、雌激素受体1（Esr1）和雌激素受体2（Esr2），其中Ar表达丰度最高，Esr1居中，Esr2最低。这为雄激素和雌激素信号可能通过直接作用于LH神经元亚群来调节性别依赖性功能提供了候选细胞基础。

**讨论与结论**：研究人员认为，LH中的性别差异并非来源于性别特异性神经元类别，而是在共享神经元结构中通过微小但可重复的分子信号权重差异实现。雌性LH神经元偏向富集AVP信号通路（Avpr1a）和辅助时钟调控因子（Per2、Per3、Nr1d2、Rora），而雄性LH神经元偏向富集VIP、NMS和CCK相关受体（Vipr2、Nmur2、Cckar）以及核心时钟正性组分（Clock、Npas2、Arntl）。这些模式在多种LH神经元群体中重复出现，提示两性可能以不同的分子权重策略参与昼夜节律调控。该研究存在若干局限：仅选取ZT12单一时间点，无法推断昼夜节律振幅、时相关系或振荡动态；动物为性腺完整且未进行发情周期分期，无法区分生物学性别与内分泌状态的作用。总体而言，研究结果支持以下结论：雌性和雄性LH神经元在单一活跃期时相表现出性别相关的转录特征，这些特征可能反映共享环路中昼夜节律信号架构的协调性差异，而非稳定的两性分子属性；将性别作为生物学变量纳入下丘脑环路转录组分析具有重要意义。