《CELL DEATH AND DIFFERENTIATION》：ATP synthase subunits e and g are essential for Ca2+ homeostasis and development in Drosophila melanogaster independent of oxidative phosphorylation
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线粒体ATP合酶（ATP synthase）除负责ATP合成及塑造嵴结构外，还被认为参与形成通透性转换孔（permeability transition pore，PTP），这是一种由Ca2?激活的高电导通道，在哺乳动物细胞中可导致基质肿胀和细胞死亡。在果蝇（
线粒体ATP合酶（ATP synthase）除负责ATP合成及塑造嵴结构外，还被认为参与形成通透性转换孔（permeability transition pore，PTP），这是一种由Ca2?激活的高电导通道，在哺乳动物细胞中可导致基质肿胀和细胞死亡。在果蝇（Drosophila melanogaster）中，PTP同源物反而形成一种选择性的Ca2?诱导Ca2?释放（Ca2?-induced Ca2? release，CICR）通道，其在生物体水平的生理意义尚不清楚。研究人员下调了果蝇中在酵母和哺乳动物细胞内PTP形成所必需的e和g亚基。两种亚基的普遍下调均导致幼虫发育停滞，而肌肉或神经元中的组织特异性抑制则导致严重的运动功能障碍。二聚化显著减少，改变了线粒体超微结构，但呼吸能力基本保留。值得注意的是，两种敲低动物的线粒体均积累了更多的Ca2?负荷，与CICR受损一致。同时伴随蜕皮激素（ecdysone，一种Ca2?依赖的变态主控激素）近乎完全缺失。神经元特异性敲低果蝇表现出线粒体Ca2?外流缺陷以及神经肌肉接头突触组织改变。总之，研究结果确立了ATP合酶作为CICR通道，调控果蝇体内Ca2?稳态、内分泌信号传导和发育。
**论文解读：ATP合酶亚基e和g通过调控钙稳态影响果蝇发育**
**一、研究背景与科学问题**
线粒体ATP合酶是一种嵌入线粒体内膜（inner mitochondrial membrane，IMM）的酶复合物，利用电子传递链产生的H?梯度将ADP和无机磷酸盐（Pi）合成为ATP。该酶由多个亚基组成，可分为催化头部（F?亲水区）、中央柄、外周柄以及膜内在区域Fo四个结构单元。其中外周柄的e和g亚基，亦称为“辅助”亚基，对于酶的二聚化至关重要，而二聚体进一步组装为寡聚体，是线粒体内膜折叠形成嵴（cristae）所必需的。在酵母或人类细胞中缺失任一亚基均会导致线粒体嵴结构异常。
除ATP合成功能外，ATP合酶还被认为参与形成通透性转换孔（permeability transition pore，PTP）。在哺乳动物中，PTP是一种高电导通道（最大电导约1.3 nS），其开放可导致线粒体内膜对离子和溶质（<1.5 kDa）的通透性增加。短暂或低电导的开放被认为参与Ca2?稳态的生理调节，而长时间高电导开放则导致线粒体去极化和肿胀，最终可能引发细胞死亡。在酵母和哺乳动物细胞中的研究表明，e和g亚基的缺失可阻止ATP合酶形成通道，提示二聚化亚基参与该酶的通道形成，且此机制可能在进化中保守。
果蝇（Drosophila melanogaster）的ATP合酶研究十分有限，尚无结构解析。然而，已有迹象表明该生物在Ca2?稳态背景下可能是该酶通道功能进化中的一个特例。果蝇线粒体在受到一系列Ca2?负荷刺激时，会发生去极化和自发性Ca2?释放，该过程看似类似PTP依赖的过程，但实际上存在根本差异：去极化和Ca2?释放通过一条对H?和Ca2?具有选择性的通路发生，不导致肿胀和细胞色素c释放，故命名为Ca2?诱导Ca2?释放（Ca2?-induced Ca2? release，CICR）通道。从果蝇中凝胶纯化的ATP合酶表现出Ca2?激活电流，电导仅为53 pS，与上述离体线粒体实验的选择性特征相吻合。
基于e和g亚基对ATP合酶生物发生和通道功能的重要性，研究人员特异性地抑制了这两种亚基在果蝇中的表达，系统研究了其生物学后果。该研究旨在揭示ATP合酶在果蝇发育中的非经典功能，特别是其作为CICR通道在Ca2?稳态、内分泌信号和突触组织中的作用。
**二、研究内容与主要结论**
研究结果表明，无论是在全身还是组织特异性水平上敲低ATP合酶e亚基（ATPsynE）或g亚基（ATPsynG），均不会导致ATP水平显著下降，而e和g亚基的缺失会引起线粒体Ca2?释放受阻，继而影响蜕皮激素的释放以及神经肌肉发育和功能。该研究提供了首个将果蝇ATP合酶与CICR通道及多细胞生物发育直接联系起来的遗传学证据。
**三、关键技术方法**
研究人员采用了多种关键技术手段：利用UAS-Gal4系统实现RNA干扰（RNA interference，RNAi）介导的基因特异性敲低，包括全身性（Act5C-Gal4）、肌肉特异性（how24B-Gal4）、运动神经元特异性（D42-Gal4）和泛神经元特异性（elavC155-Gal4）敲低；采用蓝绿温和凝胶电泳（Blue-Native PAGE，BN-PAGE）分析线粒体呼吸链复合物及ATP合酶组装状态；使用透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy，TEM）观察线粒体嵴超微结构；利用高分辨呼吸测定仪（O?k-High-Resolution Respirometer）测量线粒体耗氧率；通过钙保留能力（Calcium Retention Capacity，CRC）测定评估线粒体CICR通道功能；采用基于FRET的基因编码Ca2?传感器mitoCameleon进行体内线粒体Ca2?动态成像；结合ELISA检测血淋巴中蜕皮激素水平、qPCR分析Halloween基因表达以及RNA-seq转录组分析。样本来源为果蝇幼虫或成虫胸部组织。
**四、研究结果**
**1. ATPsynE和ATPsynG全身性下调使果蝇发育停滞在幼虫期**
通过RNAi技术全身性敲低ATPsynE（转录本降低75%）或ATPsynG（转录本降低约60%）后，个体无法正常发育，在幼虫期即停止生长，六天后体型明显减小。形态学分析显示，敲低（knockdown，KD）幼虫具有超过九颗的口钩齿和约七个前气门乳突，表明它们已进入第三龄幼虫期但无法继续发育至蛹期。值得注意的是，KD幼虫的运动活性与对照组相当。
**2. 线粒体呼吸和嵴形态在全身性KD幼虫中发生改变**
BN-PAGE分析显示，两种KD幼虫线粒体中ATP合酶二聚体和单体条带强度均低于对照组，且检测到残存的F?结构域，提示存在组装中间体积累或酶的不稳定。透射电镜观察发现KD个体线粒体嵴的数量和排列受到影响，电子密度降低。ADP刺激的偶联呼吸在两种KD幼虫中均显著下降，ATPsynG KD幼虫的最大呼吸能力亦降低。尽管存在轻微下降趋势，总ATP水平在对照组和KD之间无显著差异。但乳酸含量增加，表明糖酵解代谢代偿性增强。
**3. 肌肉特异性下调产生爬行缺陷的成虫**
肌肉特异性敲低ATPsynG可发育至成虫，而ATPsynE肌肉特异性敲低在蛹期致死，通过在18°C培养减弱Gal4表达后可获得成年果蝇。两种KD模型均表现出严重的运动障碍，ATPsynE KD果蝇爬行指数为零。BN-PAGE证实成熟ATP合酶含量减少，TEM显示嵴形态改变呈现蜂窝状结构。然而，两种亚基下调后线粒体呼吸并未受影响，总ATP水平与对照组相当。这些结果表明，观察到的强表型并非源于ATP供应限制，而是与该酶的其他功能相关。
**4. 两种KD模型中蜕皮激素几乎缺失**
全身性KD幼虫血淋巴中的蜕皮激素水平显著降低。Halloween基因（编码将胆固醇转化为蜕皮激素的酶）的表达在两种KD模型中几乎完全消失。MAPK（Ras-Erk）通路上游调节因子Egfr的转录未改变，磷酸化Erk（phosphoErk）水平亦与对照组相当，提示其他途径可能参与Halloween基因的转录调控。鉴于Ca2?在昆虫蜕皮激素合成与囊泡胞吐释放中的重要作用，这些发现暗示CICR通道受损可能导致细胞质Ca2?稳态失调，进而影响激素合成与释放。
**5. ATPsynE和ATPsynG敲低影响Ca2?释放通道**
钙保留能力（CRC）测定显示，ATPsynE和ATPsynG KD线粒体诱发Ca2?外流所需Ca2?负荷分别增加约1.5倍和3倍，表明CICR通道功能受损。在体实验中，运动神经元特异性敲低不影响基础基质Ca2?水平或KCl刺激后的Ca2?峰值幅度，但ATPsynE KD果蝇的荧光衰减时间常数（tau）显著升高，表明线粒体Ca2?外流速率减慢。这一体内测量结果与离体线粒体中CICR通道抑制一致，进一步支持ATP合酶在果蝇线粒体Ca2?处理中的直接作用。
**6. 神经元特异性敲低影响神经肌肉接头突触前末端**
泛神经元敲低ATPsynE或ATPsynG后，仅极少数成虫存活，活动困难并在数天内死亡。免疫荧光分析显示，ATPsynG KD幼虫神经肌肉接头（neuromuscular junction，NMJ）的突触前膜面积显著减小，活性区数量相当，但NMJ分支减少。已知正常的Ca2?稳态对突触生长和完整性至关重要，因此这些结果提示CICR通道抑制可能影响果蝇的生理性神经元信号传导。
**7. 讨论与结论**
该研究证明，在果蝇中下调ATP合酶e和g亚基会导致全身性敲低时幼虫期发育停滞，以及在肌肉或神经元特异性敲低时出现严重运动障碍。两种情况下均无法用ATP水平下降来解释表型，而研究揭示了Ca2?稳态失调，即通过ATP合酶（线粒体CICR通道）的线粒体Ca2?释放减少，进而影响幼虫蜕皮激素释放以及成虫神经肌肉发育和功能。该研究首次在活体多细胞生物中提供遗传学证据，将果蝇ATP合酶与CICR通道和发育直接联系起来。
ATP合酶的整体结构在进化上高度保守，但多细胞生物通过减少c亚基数量和提高H?/ATP比来满足能量需求增加。线粒体物种中外周柄获得了e、f、g等“辅助亚基”，使单体可结合为二聚体并进一步组装成寡聚体以促进嵴形成。ATP合酶的通道功能仅在高等物种中可见，其形成依赖于基质Ca2?和外周柄的完整性。果蝇中ATP合酶形成的CICR通道对Ca2?和H?具有选择性，不同于哺乳动物的PTP，后者允许离子和溶质平衡导致渗透性肿胀。果蝇的细胞凋亡内在通路与哺乳动物不同，细胞色素c释放和下游caspase激活可能不发生。这表明ATP合酶的通道功能也经历了进化。
全身性敲低e和g亚基导致三龄幼虫发育停滞和体型缩小。ATP合酶组装对干细胞分化至关重要，嵴结构缺陷可能部分解释观察到的表型。尽管线粒体超微结构破坏降低了呼吸能力，但总ATP水平在对照组和KD之间相当，这可能反映了向糖酵解代谢的转变，如乳酸水平升高所示。研究人员提出KD表型并非源于ATP合成缺陷，与之前发现一致。
Ca2?在蜕皮激素（变态的关键激素）的生物合成和释放中发挥重要作用。在前胸腺中，环境刺激通过Egfr和Torso激活MAPK/Erk通路，磷酸化Erk激活转录因子促进Halloween基因表达，负责将胆固醇转化为蜕皮激素。KD幼虫中蜕皮激素水平和Halloween基因转录本几乎缺失，尽管MAPK通路未改变。在烟草天蛾（Manduca sexta）中，诱导蜕皮激素产生的基因通过Ca2?依赖的钙调蛋白激活、cAMP产生和蛋白激酶A刺激进行转录。此外，Ca2?也是其他节肢动物蜕皮类固醇生成的主要调节因子。蜕皮激素通过囊泡以Ca2?依赖方式释放到血淋巴。因此，CICR/ATP合酶通道活性抑制导致细胞质Ca2?稳态失调，可能阻止激素合成和释放。
ATP合酶通道在体内病理生理学中的作用仍是一个开放问题。唯一可用的研究是在心肌细胞中条件性敲除g亚基的小鼠模型，其表现出对心脏缺血再灌注损伤的易感性增加。然而，该模型中呼吸和ATP产生的严重损伤不允许将该表型明确归因于ATP合酶作为PTP的功能。在本研究的果蝇模型中，全身敲低动物中呼吸仅受到轻微影响，而肌肉特异性下调的成虫中呼吸完全不受影响，ATP水平不变。相反，Ca2?处理存在明显差异，KD线粒体比对照组保留更多Ca2?。ATPsynE KD运动神经元显示线粒体Ca2?释放较慢，两种运动神经元特异性KD果蝇均表现出爬行缺陷。类似地，缺乏paraplegin 7（一种线粒体AAA蛋白酶）的痉挛性截瘫小鼠模型中观察到的运动缺陷，源于PTP闪烁活性降低对Ca2?信号传导和突触传递的有害影响。线粒体在维持神经元完整性和功能方面具有重要作用，线粒体功能障碍伴Ca2?失调在许多神经退行性疾病中很突出。KD幼虫NMJ突触前末端较小且分支较少，表明果蝇CICR通道抑制可能影响生理性神经元信号传导。Ca2?信号在果蝇幼虫NMJ发育中起关键作用，N型Ca2?通道突变导致突触生长和分支抑制，钙/钙调蛋白依赖性激酶II对NMJ的突触可塑性和重塑是必需的。
总之，该研究揭示了ATP合酶亚基e和g在CICR通道活性、Ca2?稳态和果蝇发育中的重要作用，其机制超越了ATP供应本身，为理解哺乳动物中PTP依赖性Ca2?稳态的病理生理作用奠定了基础。
