《Synthetic and Systems Biotechnology》：Genetic engineering of cyanophages for harmful cyanobacterial bloom treatment—A mini review
编辑推荐：
有害蓝藻水华（harmful cyanobacterial blooms, HCBs）是全球范围内突出的环境问题。HCBs的增殖速度超过了缓解与治理技术的发展速度。近年来，蓝藻噬菌体（cyanophage）开始被认为是一种潜在丰富的资源，可用于靶向特异性的HC
有害蓝藻水华（harmful cyanobacterial blooms, HCBs）是全球范围内突出的环境问题。HCBs的增殖速度超过了缓解与治理技术的发展速度。近年来，蓝藻噬菌体（cyanophage）开始被认为是一种潜在丰富的资源，可用于靶向特异性的HCB治理。然而，在应用基于蓝藻噬菌体的方法治理HCB时，存在两个主要的技术障碍：宿主特异性（host specificity）和溶原性生活周期（lysogenic life cycle）。本篇小型综述试图梳理已发表的、开发或应用基因工程方法或技术以克服上述障碍的研究，具体策略包括扩展宿主范围（host range）以及绕过或消除溶原性生活阶段。研究人员总结了可从噬菌体（bacteriophage）类推至蓝藻噬菌体的代表性技术方法，讨论了调控宿主结合与感染或决定裂解性（lytic）与溶原性生活周期转换的基因和通路，识别了现有的知识和技术空白及挑战，并为这个快速发展的工程化蓝藻噬菌体介导的HCB修复领域提出了一些可行的解决方案和未来展望。
1. 蓝藻噬菌体作为HCB治理工具的出现
有害蓝藻水华（HCBs）在全球范围内的规模、持续时间、频率和严重程度均呈显著上升趋势。HCBs发生时，产毒蓝藻迅速增殖，消耗水体溶解氧并释放毒素，造成缺氧或厌氧环境，对人类、宠物及野生动物构成持续性毒性威胁，同时给渔业和旅游业带来经济损失。现有HCB治理技术种类繁多，但许多方法对非靶标物种具有负面影响，且需要繁重的后处理步骤。预防HCB亦十分困难，因为淡水系统及其周边土地管理的长期改变成本高昂且耗时。近年来，蓝藻噬菌体作为一种相对新颖的治理手段开始崭露头角——它们是丰富的自然资源，仅以高度特异性的方式感染其宿主蓝藻。利用蓝藻噬菌体可以减少或避免对非靶标物种的附带损害，且无需在治理后清除释放的蓝藻噬菌体，因为它们会随宿主一同消亡。
2. 基于蓝藻噬菌体的HCB治理面临的技术障碍
利用蓝藻噬菌体治理HCB同样面临挑战。虽然部分蓝藻噬菌体能跨越不同分类目感染广谱蓝藻，但大多数宿主范围狭窄，有些仅能感染单株蓝藻。狭窄的宿主范围使得分离蓝藻噬菌体困难，且单噬菌体治理不切实际，因为大多HCB由多种蓝藻物种组成。此外，广宿主范围（generalist）蓝藻噬菌体的感染效率往往低于宿主特异性高的专一性（specialist）蓝藻噬菌体，而高裂解效率恰恰是蓝藻噬菌体治理取得成效的关键。另一个关键障碍是溶原性生活周期：在此周期中，蓝藻噬菌体整合入宿主基因组但不复制也不裂解宿主细胞。溶原性噬菌体难以识别和培养，且触发溶原性向裂解性转换的胞内外条件与胁迫因子至今未被完全理解。消除溶原性模块虽是防止溶原化的直接策略，但也可能带来环境适应性降低、传播能力改变和工程噬菌体稳定性下降等非预期后果。
3. 噬菌体基因改造概述
3.1 噬菌体裂解-溶原性决策的遗传基础
大多数已表征的溶原性噬菌体感染大肠杆菌（Escherichia coli），其中λ噬菌体的裂解-溶原性决策机制研究最为透彻。溶原性生活周期一般包括建立、维持和可能的诱导三个阶段。在λ噬菌体中，基因调控网络决定裂解-溶原性转换：cII作为正向调控因子，通过产生cI阻遏蛋白促进溶原化；cro则作为裂解调控因子，抑制cI的转录并引导噬菌体走向裂解。基于对溶原性模块的理解，cI、cII和cIII基因产物在建立和维持溶原性方面至关重要，而int基因编码的整合酶负责将噬菌体DNA重组至宿主细菌染色体中。消除或失活这些基因可能迫使蓝藻噬菌体直接进入裂解性周期。
3.2 宿主范围的遗传决定因素
宿主范围取决于噬菌体能否结合其宿主的单一受体（窄宿主范围）或多样的受体（广宿主范围）。宿主特异性的遗传决定因素包括编码受体结合蛋白（receptor binding protein, RBP）、卷尺蛋白（tape-measure protein）和噬菌体尾纤维、尾刺突或尾部组装中的解聚酶（depolymerase）等基因或基因组区域。大多数噬菌体和蓝藻噬菌体可按尾部形态分类：肌尾噬菌体（myophage）、长尾噬菌体（siphophage）和短尾噬菌体（podophage）。现有研究证据表明，扩展宿主范围的首要基因改造靶标是识别并结合宿主蓝藻表面结构的尾纤维、基板蛋白和RBP。
3.3 噬菌体基因工程方法概述
3.3.1 实验进化（Experimental evolution）
实验进化通过在受控的选择性实验室条件下繁殖生物群体，以研究或引导实时进化适应。该方法已成功用于鉴定能够感染野生型噬菌体抗性菌株的噬菌体变体，并发现了尾纤维基因和基板尾基因中的关键突变。
3.3.2 体外组装与重启（In vitro assembly and rebooting）
体外组装结合重启是一种合成生物学技术，通过化学合成或PCR扩增的DNA片段在体外组装基因组，随后导入宿主细胞以产生活性感染颗粒。与实验进化相比，体外组装可对噬菌体基因组进行靶向改造，但需要更深入的基因组知识。
3.3.3 同源重组（Homologous recombination）
同源重组涉及两条含有长段相似碱基序列的DNA链之间的遗传物质交换。该方法已被用于从噬菌体基因组中去除溶原性模块、引入解聚酶基因以增强裂解效率，以及通过GOTraP平台扩展T7噬菌体的宿主范围。
3.3.4 CRISPR/Cas系统
至少四种CRISPR/Cas系统（I、II、III和V型）已被应用于噬菌体基因工程改造，通过提供序列特异性核酸酶在噬菌体基因组中制造靶向双链断裂，再经同源重组修复实现高效的基因敲除、插入和删除。例如，ORACLE平台将位点特异性重组与Cas9负筛选相结合，成功生成了能感染野生型T7抗性菌株的T7变体。
4. 基因编辑方法在蓝藻噬菌体中的应用
4.1 已建立的蓝藻噬菌体基因工程方法
4.1.1 紫外随机诱变（Random UV mutagenesis）
紫外诱变不需要详细的噬菌体基因组知识，但由于缺乏靶向能力和蓝藻噬菌体相对较长的生长周期，该方法效率低、实用性有限。
4.1.2 体外组装
由于蓝藻噬菌体基因对大肠杆菌具有毒性，酵母平台被优先选用。研究人员成功在酿酒酵母中组装了截短的和全长的A-4(L)蓝藻噬菌体基因组，并在非宿主模型蓝藻中表达了最小化YongM基因组以鉴定感染关键基因。
4.1.3 同源重组
Shitrit等人开发了REEP（重组、富集和PCR筛选）工作流程，将重组模板通过接合导入宿主蓝藻，再以野生型蓝藻噬菌体感染。该流程虽然初始重组率仅约0.1%，但富集过程将产量提高了约100倍，已在S-TIP37、Syn5和Syn9蓝藻噬菌体中验证。
4.1.4 CRISPR/Cas系统
Yuan等人采用CRISPR-Cas12a系统替代标准同源重组方法，成功在蓝藻噬菌体A-1(L)和A-4(L)中删除靶标基因并实现基因替换与插入。Cas12a系统被选用的原因在于其在蓝藻中的效率高于Cas9系统。
4.2 蓝藻噬菌体基因工程的现状与空白
尽管噬菌体基因工程领域近年来进展迅速，但研究多集中于与人类健康相关的噬菌体，蓝藻-蓝藻噬菌体系统的研究明显不足。蓝藻噬菌体与噬菌体之间的低同源性及宿主生物过程的差异，使得已有方法不能直接应用于蓝藻噬菌体。此外，大多数蓝藻不支持细菌研究中常用的遗传操作，常见启动子可能效果不佳甚至无效，转化和同源重组方法在未经优化时耗时且低效。目前虽已发表约250个蓝藻噬菌体基因组，但仅有约40个为淡水蓝藻噬菌体，其中完全测序和注释的比例更低。
4.3 基因工程蓝藻噬菌体应用于HCB的挑战
除研究空白外，应用层面也面临多重挑战。宿主抗性的共进化是主要技术障碍之一：宿主蓝藻中多样的CRISPR-Cas系统和限制-修饰（restriction-modification, R-M）系统可主动切割入侵的蓝藻噬菌体DNA。此外，裂解产毒蓝藻可能释放胞内毒素至环境中，多项研究已证实蓝藻噬菌体感染后胞外蓝藻毒素浓度升高。公众对向淡水系统释放噬菌体的接受度也是一大考量，调查表明公众对噬菌体疗法的认知水平与其接受意愿呈正相关。基因工程蓝藻噬菌体的释放还存在转基因向非靶标水生生物水平转移的生态风险。在美国，尽管噬菌体在食品工业中的应用持续扩展，但仍有严格的监管限制；有害藻华和缺氧研究及控制修正法案（HABHRCA）报告中对生物治理方法的关注仍十分有限。
5. 结论与未来展望
蓝藻噬菌体作为具有靶向特异性的HCB治理资源潜力巨大。野生型蓝藻噬菌体的两大技术障碍——宿主特异性和溶原性周期——可通过基因工程方法加以克服。近五年来，该领域已取得显著进展：体外组装与酵母系统相结合，特别是与CRISPR/Cas系统联用的策略已被证明有效。未来，功能强大且多样化的CRISPR/Cas工具有望越来越多地应用于蓝藻噬菌体，实现高精度、高通量和高效率的靶向基因工程。同时，亟需加强快速识别和深入表征蓝藻噬菌体中负责宿主特异性和溶原性的关键基因，以及深化对蓝藻噬菌体-宿主相互作用的理解。研究人员提出了一条可行的路线图：首先以充分表征的株/种特异性蓝藻噬菌体及其原始宿主和多种不同属的非宿主蓝藻为模型系统开展概念验证（proof-of-concept）研究；成功后扩展至微观和中观实验尺度，引入温度、营养盐、光照强度、非靶标蓝藻物种和目标蓝藻种群密度等非生物与生物环境变量；若基因改造蓝藻噬菌体能在不损害非靶标物种的前提下有效感染并治理非原始宿主HCB物种，则启动现场研究以验证该新型治理技术在实际环境条件下的功效。若能在全球范围内组织并实施社区层面的协同努力，技术突破指日可待。
