一种用于检测环状RNA以实现肿瘤诊断的磁等离子体SERS生物传感器

《Spectrochimica Acta Part A: Molecular and Biomolecular Spectroscopy》：A magnetic-plasmonic SERS biosensor for detection of circular RNA toward tumor diagnosis

　　

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  开发了一种新型SERS生物传感器，用于circCDR1as的特异性检测。
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  通过将SERS与磁性富集相结合，该生物传感器实现了对circCDR1as模拟物的高灵敏度、高选择性检测。
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  在无需预先去除线性RNA的情况下，实现了对复杂细胞样本中内源性CDR1as的直接检测。
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  该生物传感器可有效依据circCDR1as的表达水平区分肿瘤细胞与正常细胞。

引言

环状RNA（circRNAs）凭借其共价闭合的环状结构而受到广泛关注，这种结构赋予其对抗外切核酸酶介导的降解的极强抵抗力，并使其稳定性显著优于传统的线性单链RNA [1], [2]。这些分子通过反向剪接机制产生，形成独特的反向剪接位点（BSJ），该位点是识别circRNAs并将其与线性RNA同物区分开的关键特征 [3], [4]。除BSJ外，circRNAs的内部序列还常含有功能性元件，例如microRNA（miRNA）结合位点，使其能够作为分子海绵发挥作用、与RNA结合蛋白相互作用，并在某些情况下作为翻译模板 [5], [6]。通过这些机制，circRNAs参与多种生物学过程，促进肿瘤发生与进展 [7], [8]。然而，circRNAs的检测面临显著挑战：其细胞内丰度普遍较低，大多数circRNAs每细胞仅存在约1–10个拷贝，对应于细胞环境中皮摩尔（pM）级的低浓度；同时，它们与相关线性转录本具有高度序列同源性，因此必须采用高特异性的检测方法以避免交叉反应。尽管存在这些障碍，特定的circRNAs已成为极具前景的诊断靶标 [9]。其中，小脑变性相关蛋白1转录本的环状RNA反义链（circCDR1as，ID: hsa_circ_0001946）是研究最为广泛者之一。circCDR1as通过近70个结合位点作为强效miR-7海绵发挥作用，在多种实体肿瘤中异常高表达，其水平升高与患者不良预后显著相关 [10], [11], [12], [13]。因此，开发针对circCDR1as的高灵敏、高特异检测技术对于推动基础研究与临床诊断应用具有至关重要的意义。

目前用于circRNA检测的方法包括Northern印迹、RNA测序、芯片分析和定量逆转录聚合酶链反应（qRT-PCR）。上述每种方法都有其独特优势，同时也存在固有局限 [14], [15]。例如，Northern印迹主要定性且劳动强度大；RNA测序虽然全面，但需要复杂的数据处理且成本高昂；qRT-PCR虽具高灵敏度，但依赖于核酸扩增，该过程耗时且可能产生非特异性信号，从而导致假阳性结果。近年来，基于纳米材料的荧光或电化学转导方法被用于circRNA检测 [16], [17]。例如，Wang等人开发了一种基于量子点的F?rster共振能量转移（FRET）纳米传感器，用于检测乳腺癌细胞及临床样本中的circMTO1 [18]；类似地，Chen等人提出了一种四面体DNA支架化电化学生物传感器用于circLMTK2的分析 [19]。这些创新策略提升了检测灵敏度；然而，荧光方法在复杂生物基质中易受自发荧光和光漂白干扰，从而降低信噪比，限制其在组织或血清样本中的应用。电化学技术则对电极表面状态及溶液离子强度的变化较为敏感，可能损害信号在不同测量间的稳定性与重现性。因此，亟需一种集高灵敏度、优异稳定性和抗背景干扰能力于一体的检测平台，以实现可靠的circRNA分析。

表面增强拉曼光谱（SERS）是一种高灵敏度的光学分析技术，在复杂生物基质中痕量生物标志物的检测方面具有巨大潜力 [20], [21]。在激光激发下，贵金属纳米结构可诱导局域表面等离子体共振（LSPR），将吸附分子的拉曼信号增强10⁶至10¹⁴倍 [22], [23]。与荧光方法不同，SERS仅提供拉曼报告分子的特征振动指纹，从而有效规避了生物样本中常见的自发荧光干扰 [24]。此外，SERS信号具有抗光漂白特性，赋予其优异的光稳定性，便于重现性检测 [25]。这些特性使SERS得以应用于复杂生物体系中蛋白、核酸、代谢物、外泌体及循环肿瘤细胞的检测 [26], [27], [28]。在circRNA检测领域，SERS展现出可观的前景。例如，已开发出集成催化发夹组装（CHA）的SERS生物传感器用于灵敏检测circSATB2，SERS也被用于circRNA表达的活细胞成像 [29], [30]。然而，生理条件下circRNAs通常低丰度存在，这使其在不借助信号放大的情况下难以实现SERS直接检测。为克服该局限，将磁性富集与SERS活性基底相结合的方法引起了广泛关注 [31]。经特异性识别元件功能化的磁性纳米颗粒能够快速从复杂样本基质中分离并浓缩目标分子，从而显著提高检测灵敏度与特异性。此类磁性SERS纳米传感器已成功用于蛋白、核酸及肿瘤细胞等多种生物靶标的检测 [32], [33]。尽管如此，其在circRNA检测以及基于circRNA表达识别肿瘤细胞方面的应用仍亟待深入探索。

本研究开发了一种磁性富集辅助的SERS生物传感器，用于检测肿瘤相关circCDR1as（图1）。该生物传感器包含两个核心功能组分：捕获探针与报告探针。捕获探针由包覆金壳层的磁性纳米颗粒组成，并经与circCDR1as BSJ互补的单链DNA序列功能化修饰，从而实现特异性识别、靶标捕获及磁性富集。报告探针由嵌入拉曼报告分子DTNB的金-银核壳纳米颗粒构成，并经与circCDR1as内部序列互补的单链DNA修饰，从而产生增强拉曼信号。当circCDR1as存在时，捕获探针通过磁分离选择性结合并富集靶标；随后，报告探针通过DNA杂交与捕获探表面结合，形成核-卫星型纳米结构。卫星纳米颗粒的数量与靶标浓度呈正相关，从而实现SERS的定量检测。本研究采用合成的circCDR1as模拟物评估生物传感器的分析性能，并通过检测细胞样本中的内源性circCDR1as进一步验证其适用性。值得注意的是，该生物传感器成功依据circCDR1as的差异表达水平区分了乳腺癌细胞与正常乳腺上皮细胞。

章节摘要

试剂与仪器

实验中所用试剂的详细信息见补充材料第1.1节。拉曼光谱使用配备638 nm激光的共聚焦拉曼光谱仪（XploRA Plus，Horiba Scientific，法国）采集。具体参数如下：激光功率设为满功率的7%（总功率30 mW），狭缝孔径300 μm，光栅狭缝100 μm，积分时间5 s，累加2次。聚焦时使用50×物镜（NA = 0.50）

捕获探针的表征

本研究构建的磁-等离子体SERS生物传感器由两个主要组分构成：捕获探针与报告探针。捕获探针通过两步工艺制备：(i) 合成磁-等离子体Fe₃O₄@SiO₂@Au纳米颗粒作为载体，(ii) 将其cDNA结合至表面，随后封闭剩余位点（图2a）。Fe₃O₄@SiO₂@Au纳米颗粒的制备方式为：首先通过水热合成形成Fe₃O₄核，随后在其表面包覆

结论

综上所述，本研究开发了一种用于检测细胞内circCDR1as的磁性SERS生物传感器。该生物传感器包含两个协同作用的功能组分：负责特异性识别与磁性富集的捕获探针，以及产生强而稳定SERS信号的报告探针。靶标结合后，这些探针通过杂交自组装为核-卫星复合结构，实现依赖于靶标的SERS信号放大。在

CRediT作者贡献声明

Dan Zhu：研究构思、可视化呈现。Na Xu：调查研究、撰写初稿。Wang Sun：调查研究。Zhuyuan Wang：资源、方法学。Shenfei Zong：资源、方法学。Jinghan Shi：验证、撰写-审阅与编辑。Qiang Liu：验证、撰写-审阅与编辑。Yiping Cui：方法学、指导监督。Yiping Wang：方法学、指导监督。

基金资助

本研究得到了国家自然科学基金（项目编号：62205149，62575140，62405139）、江苏省自然科学基金（项目编号：BK20200717）以及中国科学技术协会青年科技人才支持计划（项目编号：2022QNRC001）的资助。

利益冲突声明

作者声明不存在任何可能影响本文所述工作的已知竞争性经济利益或个人关系。

Dan Zhu|Na Xu|Wang Sun|Zhuyuan Wang|Shenfei Zong|Jinghan Shi|Qiang Liu|Yiping Cui|Yiping Wang