中性粒细胞胞外陷阱（NETs）阻断缺血性卒中中的纤维蛋白溶解并导致静脉溶栓失败

《Annals of Neurology》：Neutrophil Extracellular Traps Block Fibrinolysis in Ischemic Stroke

　　

目的：急性缺血性卒中（acute ischemic stroke, AIS）中静脉溶栓（intravenous thrombolysis, IVT）失败频繁，但其原因仍不明确。研究人员探讨了在失败的IVT中，血栓内是否达到了具有生物学意义的组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator, tPA）浓度，以及中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps, NETs）是否导致了这种治疗失败。

方法：在这项单中心队列研究中，分析了来自AIS患者的205个血栓。其中83个血栓比较了tPA含量，53个根据IVT状态比较了离体溶栓的易感性。另外一组69个AIS血栓用于阐明NETs是否以及如何干扰血栓内纤维蛋白溶解。

结果：来自IVT患者的血栓比未接受IVT患者的血栓含有两倍的tPA（p < 0.0001）。AIS血栓中的纤溶酶原和tPA与纤维蛋白、白细胞和NETs相关。尽管离体添加纤溶酶原未引起未接受IVT或接受IVT血栓的溶解，但纤溶酶原与脱氧核糖核酸酶1（deoxyribonuclease 1, DNase 1）联合使用有助于将IVT血栓中增加的tPA含量转化为增加的溶栓效果。研究人员进一步表明，DNase 1通过消除AIS血栓中的纤维蛋白溶解抑制剂，使tPA和纤溶酶介导的溶栓成为可能。

解释：这些结果表明，失败的IVT中达到的血栓内tPA浓度具有治疗潜力，但被NETs削弱；NETs促进纤维蛋白溶解抑制剂在血栓内的滞留，并可能限制tPA和纤溶酶原用于纤维蛋白溶解的可用性。研究结果强调了DNase 1在增强当前IVT tPA方案疗效方面的价值。

急性缺血性卒中（acute ischemic stroke, AIS）的静脉溶栓（intravenous thrombolysis, IVT）失败在临床中颇为常见，尤其在大血管闭塞（large vessel occlusion, LVO）患者中更为突出。既往研究虽提示IVT失败后血栓内仍可见部分纤溶迹象，但失败后的血栓中是否达到了具有生物学意义的组织型纤溶酶原激活物（tissue plasminogen activator, tPA）浓度，以及中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps, NETs，中性粒细胞释放的含DNA网状结构）是否直接阻碍了tPA介导的纤维蛋白溶解，此前尚缺乏直接证据。这一问题的阐明对于理解IVT失败机制及优化溶栓策略至关重要。

为此，研究人员开展了一项单中心队列研究，利用血管内治疗（endovascular therapy, EVT）取出的AIS血栓，系统分析了IVT相关血栓内tPA的递送情况与NETs的干扰作用。研究共纳入205例AIS血栓，结果表明，尽管IVT未能实现再通，但接受IVT的患者血栓中tPA和D-二聚体含量显著高于未接受IVT者，说明tPA确实到达了血栓并启动了纤溶。然而，单独补充纤溶酶原并不能引发血栓溶解，而联合脱氧核糖核酸酶1（deoxyribonuclease 1, DNase 1）后，血栓溶解显著增强，且溶栓程度与血栓内tPA含量正相关。进一步研究发现，DNase 1可去除血栓内与NETs结合的纤维蛋白溶解抑制剂，从而恢复tPA和纤溶酶的活性。这些结果揭示了NETs是IVT失败的重要介质，并提示DNase 1作为溶栓辅助剂的临床潜力。

在技术方法上，研究人员收集了2016年8月至2024年7月期间在Rothschild基金会医院经EVT获取的205个AIS血栓，按IVT状态分组用于不同分析。主要关键技术包括：免疫荧光染色及实时视频显微观察tPA与NETs的定位；酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）和Western blot定量血栓内tPA、纤溶酶原及纤溶抑制剂；离体溶栓实验在有无DNase 1条件下评估血栓重量变化；微流体模型用于模拟血栓形成并观察tPA与NETs的相互作用；此外还量化了血栓中DNA、糖蛋白VI（glycoprotein VI, GPVI）和血红素含量以表征细胞构成。

**研究结果**：

**1. 尽管再通失败，IVT增加AIS血栓中tPA和D-二聚体含量**
通过比较43例未接受IVT和40例接受IVT的AIS血栓，研究人员发现IVT组血栓中tPA和D-二聚体含量显著升高，而纤溶酶原、血小板、DNA和红细胞标志物无组间差异。免疫染色显示tPA与纤维蛋白、NETs及致密纤维蛋白区域共定位。Western blot分析表明，无论IVT与否，血栓内tPA主要为单链形式，并与可还原复合物相关，提示仅有部分tPA处于可自由激活纤溶酶原的状态。

**2. 离体添加DNase 1可解锁内源性和IVT相关纤溶**
离体实验中，单独添加纤溶酶原（1 μmol/L）不能使no-IVT或IVT血栓发生重量减轻。但联合DNase 1（100 μg/ml）后，两组血栓均出现显著溶解，且IVT血栓的溶解程度更高，并与血栓内tPA含量呈正相关。序贯实验显示，DNase 1预处理后洗涤去除可溶性成分，后续加入tPA和纤溶酶原仍能增强溶栓，说明DNase 1并非通过释放促纤溶因子起作用。此外，DNase 1加入后释放的D-二聚体增加，证实其促进了真正的纤维蛋白溶解。

**3. DNase 1去除纤维蛋白溶解抑制剂并促进α₂-抗纤溶酶降解**
免疫染色发现，纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）和α₂-抗纤溶酶（α₂-antiplasmin, α₂AP）均部分与NETs共定位。DNase 1处理导致血栓释放PAI-1、蛋白酶nexin-1（protease nexin-1, PN-1）和中性粒细胞弹性蛋白酶增加，但上清中α₂AP水平降低。Western blot显示，DNase 1改变了α₂AP的降解片段模式，并促进其低分子量片段生成。功能实验表明，DNase 1预处理可显著增强后续加入的纤溶酶介导的溶栓，但增强链激酶/纤溶酶原介导的溶栓作用，提示NETs的抑制效应特异针对tPA和纤溶酶途径。

**讨论与结论**
上述结果共同表明，IVT失败并非由于tPA未到达血栓，而是因为NETs通过多重机制限制了tPA的纤溶活性。NETs一方面作为非纤维蛋白骨架增加血栓稳定性，另一方面通过结合并滞留PAI-1、α₂AP等抑制剂，同时可能限制tPA和纤溶酶原与纤维蛋白的接触。DNase 1通过降解NETs，解除这些抑制作用，从而能够激发IVT已递送tPA的治疗潜力。这一发现支持将DNase 1作为tPA的辅助药物用于AIS溶栓，并提示其在极早期甚至院前给药的可能性。研究结论可概括为：尽管IVT成功增加了AIS血栓中的tPA，NETs通过降低tPA和纤溶酶原对纤维蛋白的可及性以及促进血栓内纤溶抑制剂滞留，限制了其纤溶效果；DNase 1可通过解除这些障碍而增强现有IVT方案的疗效。