**针刺通过下调SPP1改善免疫微环境减轻急性脑梗死后神经炎症的作用研究**

《Brain and Behavior》：Acupuncture Attenuates Neuroinflammation Following Acute Cerebral Infarction by Downregulating SPP1 to Ameliorate Immunological Niches

　　

背景：急性脑梗死（acute cerebral infarction, ACI）后的神经炎症在疾病病理生理过程中发挥关键作用，小胶质细胞（microglia）是最早参与应答的细胞类型。尽管针刺（acupuncture）已显示出抗炎和调节小胶质细胞的潜力，但其在重塑免疫微环境（immunological niches）中的分子机制仍不清楚。

方法：研究人员采用基于四维数据非依赖性采集（four-dimensional data-independent acquisition, 4D-DIA）的蛋白质组学技术分析ACI患者和健康对照者的血清，以鉴定差异表达蛋白（differentially expressed proteins, DEPs）。通过酶联免疫吸附试验（enzyme-linked immunosorbent assay, ELISA）对候选DEPs进行验证，并进行相关性分析。研究人员进一步采用永久性大脑中动脉阻塞（middle cerebral artery occlusion, MCAO）大鼠ACI模型，通过氯化三苯基四氮唑（triphenyltetrazolium chloride, TTC）染色、尼氏（Nissl）染色、免疫荧光染色、ELISA、蛋白质印迹（western blot）实验及实时定量聚合酶链反应（real-time quantitative PCR, RT-qPCR），探讨针刺治疗后脑损伤及小胶质细胞极化的形态学和分子生物学变化。

结果：针刺下调了MCAO大鼠和ACI患者血清中升高的分泌性磷蛋白1（secreted phosphoprotein 1, SPP1）水平。同时，针刺显著改善了MCAO大鼠的神经功能，减少了梗死体积，减轻了神经元损伤。此外，针刺促进小胶质细胞从M1型向M2型极化，降低了促炎细胞因子（白介素-6 [IL-6]、白介素-1β [IL-1β]和肿瘤坏死因子-α [TNF-α]）水平，升高了抗炎细胞因子（精氨酸酶-1 [Arg-1]、白介素-10 [IL-10]和转化生长因子-β1 [TGF-β1]）水平。此外，针刺可能通过降低SPP1表达来调节CD200/CD200R通路。

结论：针刺通过抑制MCAO后的神经炎症减轻脑损伤，该效应可能通过下调SPP1并随后调节CD200/CD200R信号通路，从而恢复缺血脑组织的免疫稳态（immune homeostasis）。

研究背景与意义

急性脑梗死（acute cerebral infarction, ACI）是全球范围内导致死亡和残疾的首要原因之一。当脑血流中断时，脑组织发生氧和营养物质匮乏，数分钟至数小时内即可触发炎症反应和免疫细胞浸润。作为中枢神经系统（central nervous system, CNS）中固有的主要先天免疫细胞，小胶质细胞（microglia）在脑低灌注引起的损伤中作出应答，其功能状态可在促炎（经典激活）的神经毒性表型与抗炎（替代激活）的神经保护表型之间连续转变。近年来，血管相关小胶质细胞（vessel-associated microglia, VAMs）被鉴定为沿血管分布的细胞亚群，其与血管内皮细胞（vascular endothelial cells, VECs）的相互作用不仅限于对血管损伤的被动反应，还可能主动参与缺血后脑组织的病理过程。ACI发生后，局部氧代谢升高及随之而来的缺氧会形成急性炎症微环境，即所谓“炎性缺氧”（inflammatory hypoxia）状态下的病理免疫微环境（immunological niches），这类微环境与VECs密切相关，并可能涉及小胶质细胞等细胞类型。因此，调控免疫微环境以减轻脑缺血诱导的神经炎症成为重要的研究方向。

针刺疗法（acupuncture）作为源自传统中医学的干预手段，已被广泛用作ACI的补充与替代疗法。研究人员的前期临床研究表明针刺干预能够安全有效地改善ACI患者的神经功能，前期的临床前荟萃分析亦提示针刺可能通过调节血管平滑肌细胞功能来改善局部脑血流量、减轻神经功能缺损。然而，针刺调控免疫微环境中VAMs的具体分子机制仍不明确。为此，本研究旨在探究针刺是否通过调节免疫微环境中小胶质细胞与血管的相互作用来减轻ACI后的神经炎症，并揭示其潜在调控机制。

关键技术方法

本研究采用临床与动物实验相结合的设计。临床部分纳入来自中国四家三级医院的多中心、假对照、随机临床试验的80名受试者：队列1纳入10名ACI患者和10名健康对照者，用于基于4D-DIA的血清蛋白质组学分析；队列2纳入60名ACI患者，随机分配至针刺组和对照组，用于ELISA验证。动物实验采用成年雄性Sprague-Dawley大鼠永久性大脑中动脉阻塞（MCAO）模型，针刺干预选用水沟穴（GV26），于造模后3小时开始，每日一次，每次20分钟，连续三天。主要技术方法包括：基于timsTOF Pro2高分辨率质谱的4D-DIA蛋白质组学分析用于筛选和鉴定差异表达蛋白（DEPs）；ELISA用于血清和脑组织蛋白水平的验证；Longa评分和改良神经功能缺损评分（mNSS）用于神经行为学评估；TTC染色用于梗死体积定量；尼氏（Nissl）染色用于神经元损伤评估；免疫荧光双染用于检测小胶质细胞标志物（Iba1）与M1/M2型标志物（CD86/CD206）、VEGF及SPP1的共定位；蛋白质印迹（western blot）和实时定量PCR（RT-qPCR）用于检测SPP1、CD200及CD200R的蛋白和mRNA表达水平；生物信息学分析包括主成分分析（PCA）、GO和KEGG通路富集分析及蛋白-蛋白相互作用（PPI）网络构建；多变量logistic回归用于评估SPP1与严重卒中的独立关联性。

研究结果

1. 蛋白质组学筛选与验证

4D-DIA蛋白质组学共检测到5020个蛋白，比较ACI患者治疗前与健康对照者共鉴定出340个疾病相关DEPs（包括191个上调蛋白和149个下调蛋白），比较ACI患者针刺治疗前后共鉴定出342个治疗相关DEPs（188个上调，154个下调）。PPI网络分析揭示SPP1-ACAN是两组DEPs中共享的互作蛋白对之一。在独立验证队列（60名ACI患者）中，ELISA检测证实针刺组治疗后血清SPP1和聚集蛋白聚糖（ACAN）水平均显著低于对照组。多变量logistic回归分析显示，基线SPP1表达水平每升高1单位，严重卒中（NIHSS>10）的风险在所有调整模型中均显著增加（完全调整模型OR: 1.23, 95% CI: 1.09–1.45, p=0.004），而ACAN与严重卒中无显著关联。SPP1表达水平与NIHSS评分呈中度正相关（R=0.54, p<0.001）。

2. 针刺减轻急性缺血性脑损伤

针刺干预显著改善了MCAO大鼠的神经功能预后：Longa评分和mNSS评分在MCAO后3、24和72小时均明显低于MCAO模型组；TTC染色显示针刺组72小时梗死体积显著减小；Nissl染色显示MCAO组缺血皮质区细胞皱缩、间隙增宽、染色加深，针刺干预在MCAO后各时间点均减轻了上述病理变化。

3. 针刺改善MCAO诱导的神经炎症

ELISA检测脑组织炎症因子发现，针刺干预显著降低了MCAO后3、24和72小时促炎细胞因子IL-6、IL-1β和TNF-α的水平，同时升高了抗炎细胞因子Arg-1、IL-10和TGF-β1的水平。免疫荧光双染进一步证实，针刺在MCAO后24和72小时显著减少了皮质和半暗带区CD86⁺/Iba1⁺（M1型）小胶质细胞数量，并在24小时增加了CD206⁺/Iba1⁺（M2型）小胶质细胞数量，表明针刺促进小胶质细胞从M1型向M2型极化。

4. 小胶质细胞-血管聚集与针刺干预

免疫荧光双染显示MCAO后皮质和半暗带区Iba1⁺小胶质细胞与VEGF阳性血管结构的共定位在3、24和72小时均增加，针刺干预减轻了这种共定位，特别是在半暗带区的24和72小时。

5. SPP1分布与针刺干预

SPP1/Iba1双染显示MCAO后皮质和半暗带区SPP1⁺/Iba1⁺细胞显著增加，针刺在3、24和72小时均降低了共定位细胞数。SPP1/VEGF双染同样显示SPP1⁺/VEGF⁺信号在MCAO后显著升高，针刺在各时间点均对此有减弱作用。

6. 针刺通过CD200/CD200R通路下调SPP1表达

Western blot和RT-qPCR检测表明，MCAO后3、24和72小时脑组织中SPP1、CD200和CD200R的蛋白及mRNA水平均显著升高，针刺干预后三者表达均明显下降。

讨论与结论

本文讨论部分指出，SPP1（又称骨桥蛋白，osteopontin）是一种分子量约45–75kDa的高度酸性胞外基质蛋白，在脑缺血后呈上调表达，参与负向调控炎症反应。已有研究表明抗SPP1抗体治疗可通过减轻缺血诱导的血脑屏障破坏来增强再灌注策略的疗效。本研究结果与上述发现一致，即ACI患者血清和MCAO大鼠脑组织中SPP1水平升高，针刺治疗可降低SPP1水平，同时改善神经功能、减少梗死体积、减轻神经元损伤并抑制神经炎症。研究还发现，针刺不仅抑制小胶质细胞向梗死血管的募集，还促进其向M2表型极化，且SPP1与小胶质细胞及VEGF阳性信号的共表达在MCAO早期即明显增加，并可为针刺有效降低。CD200/CD200R信号通路在卒中后神经炎症中发挥重要调控作用，本研究的western blot和RT-qPCR结果显示针刺干预后CD200/CD200R通路相关蛋白和基因表达整体下降，提示针刺可能通过下调SPP1表达而调节小胶质细胞-血管内皮细胞间的交叉对话（crosstalk），进而改善免疫微环境并发挥抗炎效应。

研究的局限性包括：（1）临床与动物实验中所用针刺方法存在差异，且动物与人之间的精确剂量转换存在困难；（2）SPP1的具体细胞来源尚需进一步研究；（3）针刺通过抑制SPP1表达调控CD200/CD200R通路发挥抗炎效应的机制仍需更多体内外实验加以验证。

研究结论部分明确指出：针刺可能通过下调SPP1蛋白表达来调节神经炎症；在MCAO模型中，通过降低SPP1表达，针刺可能影响小胶质细胞与血管内皮细胞之间的交叉对话，从而改善免疫微环境并发挥抗炎效应，此过程可能与CD200/CD200R信号通路相关。这些结果阐明了SPP1相关针刺治疗脑梗死的抗炎机制，其潜在临床意义值得未来进一步研究。