《Clinical and Translational Medicine》：TMEM59L promotes neuroendocrine differentiation and enzalutamide resistance in prostate cancer by regulating MUC1/β-catenin/MYC axis
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研究背景：晚期前列腺癌（PCa）中恩杂鲁胺耐药常导致治疗诱导的神经内分泌前列腺癌（t-NEPC），其特征为侵袭性谱系可塑性。调控神经内分泌分化和表型转换的分子调节因子尚不明确。本文中，研究人员表征了跨膜蛋白TMEM59L在驱动PCa进展、谱系可塑性和治疗耐药中
研究背景：晚期前列腺癌（PCa）中恩杂鲁胺耐药常导致治疗诱导的神经内分泌前列腺癌（t-NEPC），其特征为侵袭性谱系可塑性。调控神经内分泌分化和表型转换的分子调节因子尚不明确。本文中，研究人员表征了跨膜蛋白TMEM59L在驱动PCa进展、谱系可塑性和治疗耐药中的功能作用。方法：研究人员整合了批量RNA测序（bulk RNA-seq）、单细胞RNA测序（scRNA-seq）和空间转录组学（spatial transcriptomics）数据集，评估TMEM59L表达模式及其与临床特征的关联。利用恩杂鲁胺耐药（EnzR）的PCa细胞系进行体外实验和相应的小鼠异种移植模型进行体内实验，研究TMEM59L的生物学功能。通过免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down和分子对接（molecular docking）等分子实验阐明其机制性相互作用。结果：TMEM59L表达受雄激素受体（AR）信号负调控，且在EnzR PCa组织中显著升高。在PCa细胞中，异位TMEM59L表达可诱导神经内分泌样表型、增强干性（stemness）、促进上皮-间质转化（EMT）并赋予恩杂鲁胺耐药性。相反，TMEM59L敲低可恢复药物敏感性并显著抑制体内EnzR肿瘤生长。机制上，TMEM59L直接与MUC1相互作用，促进其向细胞核内积累，从而激活下游β-连环蛋白（β-catenin）/MYC信号轴。重要的是，药理抑制或基因沉默MUC1可有效逆转TMEM59L诱导的神经内分泌分化、干性和恩杂鲁胺耐药。结论：研究人员的发现揭示了一条此前未被认识的、与PCa神经内分泌分化和恩杂鲁胺耐药相关的TMEM59L/MUC1/β-catenin/MYC信号级联通路。靶向该调控轴为规避下一代AR信号抑制剂（ARSIs）耐药性提供了一种有前景的治疗策略。
**论文解读：TMEM59L驱动前列腺癌恩杂鲁胺耐药与神经内分泌分化的分子机制研究**
**一、研究背景与科学问题**
前列腺癌（Prostate cancer，PCa）是全球范围内导致男性肿瘤相关死亡的主要病种之一。雄激素剥夺治疗（Androgen deprivation therapy，ADT）是晚期PCa的基础治疗手段，但多数患者最终会进展为去势抵抗性前列腺癌（Castration-resistant prostate cancer，CRPC）。以恩杂鲁胺（enzalutamide）为代表的下一代雄激素受体信号抑制剂（AR signalling inhibitors，ARSIs）虽被广泛用于CRPC治疗，其临床获益却常因获得性耐药而受限。
更值得注意的是，持续的AR通路抑制可诱发肿瘤细胞的谱系可塑性（lineage plasticity），导致治疗诱导的神经内分泌前列腺癌（treatment-induced neuroendocrine prostate cancer，t-NEPC）的出现。t-NEPC在晚期转移性去势抵抗性前列腺癌（metastatic CRPC，mCRPC）中的发生率可高达17%，且患者5年生存率仅约10%，预后极差。在分子水平上，NEPC通常伴随AR信号减弱、肿瘤抑制因子p53和RB缺失以及神经谱系调节因子（如BRN2）的激活，同时干性增强、上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）及SOX2诱导也参与其中。然而，调控神经内分泌分化（neuroendocrine differentiation，NED）和表型转换的关键分子节点仍未被充分阐明。
TMEM59L是一种I型跨膜蛋白（type-I transmembrane protein），既往研究主要关注其在中枢神经系统中的功能，包括调节淀粉样前体蛋白（amyloid precursor protein，APP）转运和ATG16L1介导的非经典自噬。近年来虽有零星证据提示TMEM59L与胶质瘤和结直肠癌进展有关，但其在AR信号、神经谱系可塑性及PCa治疗耐药中的作用几乎未被探索。在此背景下，研究人员开展了此项研究，旨在系统解析TMEM59L在PCa进展和恩杂鲁胺耐药中的功能角色及其分子机制，为克服ARSIs耐药提供新的靶向策略。
**二、主要技术方法概述**
研究人员综合运用了多层次的研究手段。在生物信息学层面，整合分析了来自9个数据集的181例前列腺样本的单细胞RNA测序（scRNA-seq）数据（涵盖健康对照、良性前列腺增生、治疗初治PCa、新辅助内分泌治疗后、CRPC及mCRPC等多种疾病状态）、52例空间转录组（spatial transcriptomics）图谱（基于10x Genomics Visium平台），以及TCGA-PRAD、Beltran 2016、SU2C、GSE126078等多个公开批量转录组队列数据。功能实验方面，建立了恩杂鲁胺耐药LNCaP细胞系（LNCaP EnzR，通过递增浓度恩杂鲁胺处理约6个月获得），并构建了TMEM59L过表达和敲低稳转细胞模型。机制研究采用了免疫共沉淀（Co-IP）、GST pull-down及分子对接（molecular docking）等蛋白互作分析技术。体内实验使用雄性BALB/c裸鼠皮下异种移植模型，结合手术去势和恩杂鲁胺灌胃给药，验证TMEM59L的致瘤功能。临床验证方面，回顾性收集了上海交通大学医学院附属新华医院的86例前列腺腺癌石蜡包埋组织标本（按Gleason评分分为GS<7、GS=7和GS>7三组），进行免疫组化和多重免疫荧光分析。
**三、主要研究结果**
**3.1 TMEM59L在恩杂鲁胺耐药前列腺癌中上调且响应雄激素调控**
研究人员首先发现，在LNCaP细胞中，双氢睾酮（DHT）处理以时间依赖性方式降低TMEM59L的信使RNA和蛋白水平，而恩杂鲁胺则显著上调其表达。在LNCaP EnzR细胞中，TMEM59L表达水平明显高于亲代细胞，且恩杂鲁胺处理可进一步放大该差异。DHT以剂量依赖方式降低EnzR细胞中TMEM59L蛋白表达，恩杂鲁胺则可逆转这一效应。基因集富集分析（Gene Set Enrichment Analysis，GSEA）显示，TCGA-PRAD队列中雄激素应答信号活性与TMEM59L表达呈显著负相关。多数据集生物信息学分析进一步证实，TMEM59L在EnzR细胞系和雄激素剥夺异种移植肿瘤中均显著升高。在TCGA-PRAD队列中，TMEM59L表达随Gleason评分升高而增加，并与PSA水平、T分期和淋巴结转移相关。在研究人员独立的86例临床队列中，TMEM59L高表达标本的比例从低Gleason评分组到高评分组逐步上升，多重免疫荧光进一步确认TMEM59L主要定位于AMACR阳性/p63阴性的恶性上皮区域。生存分析显示，TMEM59L高表达与较差的总生存期、无病生存期、无进展生存期和生化无复发生存期显著相关。
**3.2 TMEM59L促进恩杂鲁胺耐药和耐药肿瘤进展**
DepMap门户的CRISPR-Cas9敲除筛选数据显示，TMEM59L基因效应评分在前列腺癌细胞系中普遍为负值，提示其缺失可普遍抑制细胞生长或诱导死亡。功能实验表明，TMEM59L敲低可显著恢复EnzR细胞对恩杂鲁胺的敏感性，而过表达则在亲代细胞中赋予耐药性。CCK-8和集落形成实验证实，TMEM59L敲低联合恩杂鲁胺处理可降低EnzR细胞增殖速率和克隆形成能力，而过表达则保护亲代细胞免受恩杂鲁胺诱导的生长抑制。体内实验中，接种shTMEM59L LNCaP EnzR细胞的去势裸鼠在恩杂鲁胺治疗下，肿瘤体积和重量均显著低于对照组。在22Rv1异种移植模型中进行的回复实验进一步证实了靶点特异性：TMEM59L敲低显著抑制22Rv1肿瘤生长，而外源性回补TMEM59L可完全逆转这一肿瘤抑制表型。
**3.3 基于scRNA-seq数据鉴定TMEM59L相关转录模式**
通过对9个数据集共386,664个单细胞的整合分析，研究人员鉴定出包括NK细胞、CD4
+ T细胞、CD8
+ T细胞、B细胞、浆细胞、单核细胞、巨噬细胞、树突状细胞亚群、肥大细胞、成纤维细胞、平滑肌细胞、周细胞、内皮细胞、管腔细胞、基底细胞和神经内分泌（NE）细胞在内的主要细胞群体。NE细胞比例在晚期T分期、淋巴结转移、远处转移及更高分级组别中显著增加。伪批量分析显示，TMEM59L在肿瘤组织中表达显著高于非恶性组织，在新辅助内分泌治疗后和mCRPC样本中表达高于治疗初治PCa。CellChat细胞间通讯分析表明，TMEM59L阳性上皮细胞在睾酮和DHT信号网络中占据更中心的地位，且睾酮-HSD17B12-AR和DHT-SRD5A3-AR构成主要的配体-受体通讯轴。在mCRPC特异性分析中，TMEM59L阳性上皮细胞在睾酮信号网络中展现出最高的发送者、接收者、中介者和影响者重要性评分。
**3.4 TMEM59L促进前列腺癌神经内分泌分化**
研究人员在多个独立队列（Beltran 2016、GSE66187、SU2C和GSE126078）中发现TMEM59L表达与NE评分呈显著正相关。CRPC和mCRPC样本的单细胞伪批量分析进一步显示，TMEM59L表达与NE评分及SYP、CHGA、ENO2等NE标志物水平呈强正相关。Beltran 2016队列中，TMEM59L在CRPC-NEPC中表达显著高于CRPC-腺癌。GSEA分析显示，TMEM59L高表达肿瘤中HP_NEUROENDOCRINE_NEOPLASM特征基因集显著富集。空间转录组分析也证实TMEM59L富集区域与CHGA、ENO2和SYP富集区域高度重叠。功能实验方面，TMEM59L过表达在多种PCa细胞系中上调CHGA、ENO2和SYP表达。在EnzR细胞中，TMEM59L敲低显著减轻了恩杂鲁胺诱导的NE标志物表达升高。在AR非依赖的NCI-H660和DU145细胞中，两条独立shRNA敲低TMEM59L均可广泛下调ENO2、SYP以及谱系可塑性调节因子BRN2、SOX2和ASCL1。此外，DHT处理未能使TMEM59L过表达LNCaP细胞中升高的NE标志物和谱系调节因子恢复正常，提示TMEM59L诱导的NE相关谱系程序对雄激素刺激具有抵抗性。
**3.5 TMEM59L驱动PCa的EMT和肿瘤干性**
研究发现TMEM59L和干性标志物在LNCaP EnzR和22Rv1细胞形成的肿瘤球中相较贴壁细胞显著富集。TCGA-PRAD队列的GSEA分析证实TMEM59L水平与EMT信号特征呈强正相关。TMEM59L敲低可导致干性标志物CD133和CD44及间质标志物N-钙黏蛋白（N-cadherin）表达显著下降，同时上调E-钙黏蛋白（E-cadherin），且功能上显著削弱PCa细胞的迁移、侵袭和成球能力。反之，TMEM59L过表达则上调CD133、CD44和N-cadherin、抑制E-cadherin，并增强迁移、侵袭和成球能力。
**3.6 TMEM59L与MUC1相互作用并促进其核积累**
通过查询intAct和GeneMANIA数据库，研究人员鉴定出黏蛋白1（Mucin 1，MUC1）为TMEM59L的潜在相互作用蛋白。GRAMM分子对接预测TMEM59L与MUC1可形成稳定蛋白复合物，其中TMEM59L Cys326与MUC1 Tyr1218之间预测距离约为2.4 ?。Co-IP实验在LNCaP EnzR、22Rv1和C4-2细胞中验证了内源性TMEM59L-MUC1结合，GST pull-down进一步证实该结合为直接相互作用。将TMEM59L C326A或MUC1 Y1218A突变可显著削弱二者结合。多重免疫荧光在人PCa组织中显示TMEM59L与MUC1、ENO2和SYP在同一肿瘤区域内存在空间共定位。免疫荧光和亚细胞组分分离实验进一步表明，TMEM59L过表达可显著增加MUC1在细胞核中的积累水平。
**3.7 TMEM59L通过MUC1/β-catenin/MYC信号调控恩杂鲁胺耐药和神经内分泌分化**
研究人员首先证实DHT降低MUC1表达同时上调PSA，恩杂鲁胺则升高MUC1并降低PSA，揭示MUC1与AR信号之间存在负调控关系。在TMEM59L过表达LNCaP细胞中，shMUC1敲低或MUC1-C抑制剂GO-203处理均可显著增强恩杂鲁胺对细胞活力的抑制效果，并降低克隆形成存活。在体内，TMEM59L过表达肿瘤在恩杂鲁胺治疗下表现出加速生长，而联合GO-203可显著抑制肿瘤生长和终末重量。此外，GO-203处理NCI-H660细胞或shMUC1处理DU145细胞均可降低BRN2、SOX2、ASCL1及NE标志物ENO2和SYP的表达。
基于scRNA-seq数据的scTenifoldKnk虚拟敲除分析显示，敲除TMEM59L可扰动108个基因的表达，GSEA分析显示这些扰动基因以下调Wnt/β-catenin信号和上调AR应答通路为特征。蛋白质印迹实验证实TMEM59L敲低下调MYC、β-catenin及其下游效应分子Cyclin D1和MMP-7，过表达则上调之。在TMEM59L过表达细胞中，shMUC1或GO-203处理均可抑制β-catenin/MYC通路组分、干性标志物（CD44、CD133）、NE标志物（ENO2、SYP）和N-cadherin的表达，同时上调E-cadherin。
**3.8 TMEM59L敲低或MUC1-C抑制在体内抑制异种移植肿瘤生长和NE相关信号**
在LNCaP EnzR异种移植模型中，TMEM59L敲低和GO-203处理在对照和恩杂鲁胺治疗条件下均可显著抑制肿瘤生长并降低终末肿瘤重量。免疫组化分析显示，TMEM59L敲低降低NE标志物CHGA、SYP和ENO2以及下游蛋白β-catenin和MYC的表达；GO-203产生类似的下游效应但不显著改变TMEM59L表达，与MUC1-C位于TMEM59L下游的机制一致。两种干预手段还降低了核MUC1和核β-catenin阳性细胞比例。
**四、讨论与结论**
本研究揭示了TMEM59L作为前列腺癌治疗耐药和神经谱系可塑性的关键调控因子。TMEM59L受AR信号负调控，在恩杂鲁胺耐药PCa中显著上调，并通过与MUC1直接相互作用、促进MUC1核积累，激活β-catenin/MYC信号级联，进而驱动NE分化、EMT和干性，最终促进恩杂鲁胺耐药。值得注意的是，TMEM59L的促瘤效应并不局限于驱动NEPC转化，其通过EMT、干性和治疗耐药促进AR阳性肿瘤进展的功能同样具有重要意义。
研究也存在若干局限性：TMEM59L上游调控机制尚不完全清楚，尤其是介导AR信号抑制效应的转录因子和表观遗传调控因子有待鉴定；需要转基因小鼠模型或患者来源异种移植模型进一步验证；PCa耐药涉及复杂的信号网络和肿瘤微环境互作，TMEM59L所处的更广泛信号景观需进一步探索；此外，由于临床队列规模的限制，TMEM59L表达与临床谱系转换的关系需在更大规模、谱系定义明确的队列中验证。
未来研究方向包括：解析控制TMEM59L转录的调控元件以发现预防治疗诱导谱系可塑性的新靶点；评估TMEM59L作为预测治疗耐药和疾病进展生物标志物的潜力；探索靶向TMEM59L/MUC1/β-catenin/MYC信号轴的药物治疗策略，以恢复AR靶向治疗敏感性并预防侵袭性肿瘤表型的出现。
研究结论：研究人员的发现揭示了一条此前未被认识的、与PCa神经内分泌分化和恩杂鲁胺耐药相关的TMEM59L/MUC1/β-catenin/MYC信号级联通路。靶向该调控轴为规避下一代AR信号抑制剂耐药性提供了一种有前景的治疗策略。
