MYCN驱动型神经母细胞瘤骨髓微环境中的免疫重塑与髓系特征（Immune remodeling and myeloid signature in the bone marrow niche of MYCN-driven neuroblastoma）

《BJC Reports》：Immune remodeling and myeloid signature in the bone marrow niche of MYCN-driven neuroblastoma

　　

摘要专业翻译 背景：高危型MYCN扩增（MYCN-amplified）神经母细胞瘤（neuroblastoma）预后极差，常转移至骨髓（bone marrow）。然而，系统性免疫重塑及其对骨髓微环境（bone marrow niche）的影响尚不明确。 方法：研究人员利用单细胞RNA测序（single-cell RNA sequencing, scRNA-seq），比较了野生型（wild-type, WT）小鼠与TH-MYCN转基因小鼠的骨髓免疫细胞景观。 结果：TH-MYCN小鼠表现出中性粒细胞（neutrophils）和Cd300e?髓系细胞（myeloid cells）增加，发育中B细胞（developing B cells）减少，这与研究人员在人类神经母细胞瘤骨髓转移中的发现相呼应。配体-受体（ligand-receptor）分析揭示了TH-MYCN骨髓中ADGRG和SEMA4信号通路的富集，突出了Tgm2-Adgrg1、Sema4D-Plxnb2和Sema4D-Cd72相互作用作为潜在免疫调节因子。相比之下，CD45和CEACAM通路在WT小鼠中更为显著，提示存在背景特异性免疫调控。在TH-MYCN小鼠中富集的一个独特的Cd300e?Pecam1?髓系细胞群，表现出包括Fabp4、Ear2（Nr2f6）和Treml4在内的基因特征，这些基因与神经母细胞瘤分期及不良生存相关。在MYCN扩增型神经母细胞瘤复发中富集的FABP4?巨噬细胞（FABP4? macrophages），已被证实可增强肿瘤细胞迁移、侵袭和生长。 结论：研究数据揭示了原发肿瘤对骨髓免疫组成和信号传导的远距离影响。这些关于骨髓免疫重塑的见解，突出了FABP4?巨噬细胞和semaphorin信号通路作为干扰神经母细胞瘤进展的潜在免疫治疗靶点。

论文解读

一、研究背景与科学问题

神经母细胞瘤是一种高度转移性的儿童恶性肿瘤，大多数患者在诊断时已发生转移。骨髓和骨骼是最常见的转移部位，占转移性神经母细胞瘤患者的70%以上，且与更差的总生存率相关。MYCN癌基因扩增见于约20%的神经母细胞瘤患者，是风险分层的重要预后标志物，与侵袭性疾病进展密切相关。在酪氨酸羟化酶（tyrosine hydroxylase, TH）启动子驱动下过表达MYCN的小鼠，可仅在交感肾上腺系统产生肿瘤，模拟人类MYCN扩增型神经母细胞瘤的特征。

尽管已有研究通过单细胞转录组学（single-cell transcriptomics）绘制了人类神经母细胞瘤骨髓转移的免疫抑制性微环境图谱，发现转移性骨髓龛中未成熟中性粒细胞、中性粒细胞和细胞毒性T细胞增加，而发育中B细胞耗竭，但原发肿瘤对远处骨髓免疫组成和信号传导的系统性影响仍不清楚。TH-MYCN小鼠虽然骨髓转移发生率极低（<5%），但为研究远处原发肿瘤对骨髓微环境重塑的影响提供了宝贵的免疫活性模型。本研究旨在通过单细胞RNA测序，系统比较野生型与TH-MYCN转基因小鼠的骨髓免疫细胞景观，揭示原发肿瘤对骨髓的远距离影响及其分子机制。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员对5只TH-MYCN转基因小鼠（129×1/SvJ背景，包括3只纯合子，37、40、41日龄；2只半合子，58、97日龄）和3只野生型小鼠（129×1/SvJ背景，90、46、48日龄）的股骨、胫骨及肿瘤组织进行机械和酶解离，经FACS富集活细胞后，使用10x Genomics Chromium 3' v2试剂盒构建文库，在Illumina NextSeq 550平台测序。原始数据使用Cellranger v6.1.2比对至修饰的GRCm38参考基因组（转基因样本附加MYCN染色体），经质量控制后使用Seurat v4.9.9流程进行整合、归一化、高变基因鉴定和聚类分析，并使用CellChat v1.5.0进行细胞间相互作用分析。此外，研究还采用了石蜡包埋脱钙骨组织的免疫组化（immunohistochemistry, IHC）和免疫荧光（immunofluorescence, IF）染色验证关键蛋白表达，使用ZEISS Axioscan 7和QuPath v0.5.1进行定量图像分析，Zeiss LSM980-Airy共聚焦显微镜成像，GraphPad Prism v10.4.1进行统计分析。临床验证使用了SEQC-489神经母细胞瘤患者队列（n=498，GEO: GSE49711）和Versteeg队列（GEO: GSE16476）的公开数据。

三、主要研究结果

1. TH-MYCN小鼠骨髓和原发肿瘤的免疫微环境单细胞转录组图谱

研究人员对5只TH-MYCN小鼠的配对骨髓和肿瘤样本以及3只WT小鼠的骨髓样本进行scRNA-seq，骨髓测序获得34,399个细胞，肿瘤测序获得42,332个细胞。骨髓无偏聚类揭示了17个免疫细胞簇，涵盖从造血前体细胞向B细胞、红系、粒细胞和髓系分化的连续造血过程。B细胞发育呈现7个亚群：pro B细胞（Vpreb1）、cycling pro B细胞1（Bok）、cycling pro B细胞2（E2f1）、cycling pro B细胞3（Mki67）、pre B细胞（Arl5c）、未成熟B细胞（Tnfrsf13c）和成熟B细胞（Bank1）。值得注意的是，一个表达Cd300e的独特髓系细胞群在UMAP嵌入中与其他髓系群体分离。与WT相比，TH-MYCN小鼠骨髓中Cd300e?髓系细胞群比例增加，中性粒细胞群体增加，发育中B细胞簇减少，这些趋势与人类神经母细胞瘤骨髓转移微环境的研究发现一致。免疫组化未检测到N-MYC或PHOX2B阳性肿瘤细胞，转录组分析也未在骨髓中鉴定出明确的肿瘤细胞群体，证实这些变化源于远处原发肿瘤的影响而非骨髓浸润。

2. TH-MYCN骨髓中背景特异性免疫调节相互作用

CellChat分析显示，巨噬细胞、成熟中性粒细胞和髓系细胞是骨髓中主要的信号来源。WT骨髓中成熟B细胞是主要信号靶点，而TH-MYCN骨髓中未成熟B细胞是主要靶点。GAP、CD86和ADGRG通路仅在TH-MYCN骨髓中检测到。CD45和CEACAM通路在WT骨髓中更为显著，其中Ptprc-Cd22配体-受体对贡献了CD45信号，Ceacam1-Ceacam1、Ceacam1-Cd209d、Ceacam1-Cd1d1和Cd209a-Ceacam1贡献了CEACAM信号。高表达PTPRC、CD22、CD1D、CEACAM1和CD209均与SEQC-489神经母细胞瘤患者队列中更好的临床结局相关。SEMA4信号通路在TH-MYCN骨髓中占主导，其配体-受体对包括Sema4d-Cd72、Sema4a-Plxnb2和Sema4d-Plxnb2。免疫组化证实TH-MYCN骨中SEMA4D?细胞比例高于WT骨。ADGRG信号通路仅在TH-MYCN骨髓中检测到，其信号来源为独特的髓系细胞群，关键配体-受体对为Tgm2-Adgrg1，信号网络显示从髓系细胞向pro B细胞群的通讯。免疫染色证实TGM2与GPR56/ADGRG1在TH-MYCN骨中共定位。高表达TGM2和ADGRG1在三个神经母细胞瘤患者队列中均与不良预后相关。

3. 神经母细胞瘤骨髓微环境中独特的髓系细胞特征

将TH-MYCN骨髓与配对肿瘤的免疫细胞联合比对，发现主要重叠群体包括T细胞、NK细胞、成熟B细胞、成熟中性粒细胞2、树突状细胞（dendritic cells, DCs）、巨噬细胞和髓系细胞。髓系亚群分析鉴定出三种主要巨噬细胞基因特征：Pecam1?、Ccr2?和Apoe?巨噬细胞。Pecam1?巨噬细胞亚群以Cd300e表达为标志，被注释为Myeloid-1，是骨髓中占主导的髓系亚群，表现出独特的基因表达谱：Pecam1、Cd300e、Fcgr4、Cd9、Fabp4、Treml4。免疫荧光检测显示TH-MYCN骨中FABP4?巨噬细胞丰度高于WT骨。在SEQC-489队列中，FABP4表达随INSS分期增加而升高；高表达EAR2（NR2F6）和TREML4与更差的总生存相关。将CD300E和PECAM1映射到人类神经母细胞瘤骨髓转移数据中，证实其在转移样本的巨噬细胞中特异性表达，且该巨噬细胞簇中SIGLEC10为差异表达基因之一，与先前报道的CD24-SIGLEC10肿瘤-巨噬细胞免疫逃逸相互作用一致。

四、讨论与结论

本研究发现TH-MYCN荷瘤小鼠骨髓中中性粒细胞和Cd300e?髓系细胞增加、发育中B细胞减少，这些趋势与人类神经母细胞瘤骨髓转移中的发现一致，提示原发肿瘤对骨髓产生远距离免疫重塑效应。GAP、CD86和ADGRG通路仅在TH-MYCN骨髓中检测到，其中CD86-CD28共刺激轴在CTLA-4高表达条件下支持调节性T细胞（regulatory T cells, Tregs）扩增；ADGRG1在乳腺癌细胞中促进骨转移形成。SEMA4通路中Sema4D-Plexin-B2轴参与内皮细胞迁移和血管生成以支持肿瘤生长，Sema4D-Cd72相互作用调节B细胞活化，且Sema4D在骨重塑和骨转移微环境建立中发挥重要作用。独特的Cd300e?Pecam1?髓系细胞群与肿瘤中Pecam1?巨噬细胞亚群相似，富集Fabp4、Ear2（Nr2f6）和Treml4等与不良预后相关的基因。孤儿核受体Ear2（Nr2f6）已被提出作为癌症免疫治疗的免疫检查点靶点。FABP4?巨噬细胞通过泛素化ATPB使NF-κB-IL1α通路失活，促进神经母细胞瘤细胞迁移、侵袭和肿瘤生长。

研究结论：研究数据揭示了原发肿瘤对骨髓免疫组成和信号传导的远距离影响。这些关于骨髓免疫重塑的见解，突出了FABP4?巨噬细胞和semaphorin信号通路作为干扰神经母细胞瘤进展的潜在免疫治疗靶点。