《JOURNAL OF FOOD PROCESSING AND PRESERVATION》：Preparation of Walnut Protein by Ultrasonic-Assisted Enzymatic Hydrolysis and Cross-Linking and Its Structural and Functional Properties
编辑推荐：
摘要专业翻译
以冷榨核桃粕为蛋白来源，研究通过超声辅助酶解结合谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase, TGase）介导的交联作用制备和修饰核桃蛋白。在对五种蛋白酶进行初步筛选后，选择碱性蛋白酶进行进一步研究。采用单因素实验和响应面法（respons
摘要专业翻译
以冷榨核桃粕为蛋白来源，研究通过超声辅助酶解结合谷氨酰胺转氨酶（transglutaminase, TGase）介导的交联作用制备和修饰核桃蛋白。在对五种蛋白酶进行初步筛选后，选择碱性蛋白酶进行进一步研究。采用单因素实验和响应面法（response surface methodology, RSM）优化水解条件。最优条件为pH 9.8、酶添加量4250 U/g、超声功率250 W处理15 min、料液比1:32（g/mL）、52°C水解60 min，蛋白质提取率达82.42%。随后采用膜分离结合酸醇沉淀法进行蛋白纯化。最优醇沉条件为86%乙醇、4°C沉淀9.4 h，而最优酸沉条件为pH 4.5、4°C沉淀3 h。在此条件下，蛋白质沉淀率达89.13%，最终纯度为83.35%。纯化后的蛋白进一步通过TGase诱导交联进行修饰，并系统表征了其氨基酸组成和空间结构特征。该研究为核桃源蛋白的制备和结构修饰提供了一种高效且可规模化放大的潜在策略，在生物活性肽开发和功能性蛋白研究方面具有广阔的应用前景。
论文解读文章
一、研究背景与意义
核桃（Juglans regia L.）是我国重要的木本油料作物，2024年全国年产量约587万吨，居世界首位。冷榨法是核桃油提取的常用方法，因其条件温和、能较好保留原料生物活性而被广泛采用。然而，冷榨过程产生的大量核桃粕副产物虽富含蛋白质，却主要被用作动物饲料或肥料，造成优质蛋白资源的严重浪费。核桃粕蛋白氨基酸组成完整，谷氨酸、精氨酸和天冬氨酸含量尤为丰富，这些氨基酸与核桃的益智功效密切相关，因此开发核桃蛋白产品具有重要的实际意义和广阔的市场前景。
目前核桃蛋白的提取方法主要包括碱溶酸沉法、酶解法、物理辅助碱提法和反胶束法等。碱溶酸沉法操作简单但需使用有机溶剂，存在安全隐患，且所得蛋白色泽偏深、功能特性下降；酶解法条件温和、绿色安全，但酶成本高、提取率波动大且需进一步纯化；物理辅助碱提法需大量设备投入且有蛋白变性风险；反胶束法虽能保持蛋白活性，但体系复杂、效率低、难以工业化放大。在蛋白改性方面，传统物理和化学方法存在可控性差或潜在毒性等问题。尽管已有多种核桃蛋白提取和改性方法被报道，但鲜有研究提出能同时提高蛋白纯度、改善色泽和增强功能特性的集成策略。
二、研究内容与结论
针对上述问题，研究人员提出了一种集成超声辅助酶解、膜分离纯化、酸醇沉淀和TGase介导交联的核桃蛋白制备新策略，旨在同时提升核桃蛋白的纯度、色泽、结构特征和功能特性，为冷榨核桃粕的高值化利用提供理论支持和技术途径。
三、关键技术方法
研究人员采用的主要技术方法包括：蛋白酶筛选与超声辅助碱性蛋白酶水解（结合Plackett–Burman设计和响应面法优化水解条件）；膜分离（0.45 μm微滤和10 kDa超滤）结合酸醇沉淀纯化蛋白；TGase交联改性；凯氏定氮法测定蛋白含量；氨基酸分析仪测定氨基酸组成；扫描电子显微镜（SEM）观察微观结构；傅里叶变换红外光谱（FTIR）分析分子结构变化；以及蛋白溶解性、起泡性、乳化性、吸水性、吸油性和抗氧化活性等功能特性评价。
四、研究结果
冷榨核桃粕蛋白含量与氨基酸组成测定：冷榨核桃粕蛋白含量为49.36% ± 0.23%，含有16种氨基酸，其中谷氨酸（21.35%）、精氨酸（18.83%）和天冬氨酸（10.25%）含量最高。
蛋白酶筛选：碱性蛋白酶的水解效果显著优于中性蛋白酶、木瓜蛋白酶、纤维素酶和胰蛋白酶（p < 0.001），这主要归因于碱性蛋白酶能水解疏水性氨基酸残基、增强蛋白溶解性，且核桃蛋白以谷蛋白为主，在碱性条件下溶解性更好。
超声辅助碱性蛋白酶水解单因素实验：蛋白提取率随pH、酶添加量、水解时间和料液比的增加而升高，分别在pH 9.0、酶添加量4000 U/g、水解时间60 min和料液比1:30 g/mL时达到最大值；水解温度对提取率的影响呈钟形趋势，50°C为最适温度。
Plackett–Burman实验设计：各因素对蛋白提取率影响的顺序为pH > 料液比 > 酶添加量 > 温度 > 时间，据此筛选出前四个显著因素进行响应面优化。
响应面优化超声辅助酶解：建立的四因素三水平响应面模型极显著（p < 0.0001），R2 = 0.9985。最优条件为pH 9.8、碱性蛋白酶添加量4250 U/g、超声功率250 W处理15 min、料液比1:32 g/mL、52°C水解60 min，预测提取率为82.09%，验证实验实际提取率达82.42%，与预测值高度吻合。
酸醇沉淀单因素实验：乙醇浓度为85%时蛋白沉淀率最高；沉淀时间8 h时沉淀率达到最大值，超过8 h后略有下降；5°C时沉淀率最高，温度超过5°C后沉淀率显著下降。
响应面优化酸醇沉淀：模型极显著（p < 0.0001），R2 = 0.9985。各因素影响顺序为乙醇浓度 > 温度 > 时间。最优条件为乙醇浓度86%、4°C沉淀9.4 h，结合pH 4.5、4°C酸沉3 h，预测沉淀率为88.12%，验证实验实际沉淀率达89.13%。最终获得的纯化核桃蛋白纯度为83.35%，得率为73.47%。
核桃蛋白氨基酸组成：纯化后的核桃蛋白含16种氨基酸，谷氨酸（19.61%）、精氨酸（17.04%）和天冬氨酸（10.66%）含量最高。谷氨酸和天冬氨酸为酸性氨基酸，能减弱自由基链式反应，具有抗氧化活性；谷氨酸还可通过NMDA受体调节长时程增强从而增强记忆；精氨酸作为一氧化氮合酶的底物，可产生内源性自由基清除剂一氧化氮。
空间结构研究：SEM观察显示，冷榨核桃粕呈致密聚集结构，而经超声辅助酶解结合交联制备的核桃蛋白呈现疏松柔韧的网络结构，表明超声辅助酶解使蛋白结构逐渐展开拉伸，交联促进了蛋白内部网络的形成。
FTIR光谱分析：交联前后样品均呈现相似的特征吸收带。约3278.5–3279.4 cm?1处的宽吸收带归属于–OH和N–H伸缩振动，交联后该吸收带向高波数轻微移动，表明氢键和局部化学环境发生变化。酰胺I（1633.2至1627.6 cm?1）、酰胺II（1519.6–1520.7 cm?1）和酰胺III（1233.9–1235.0 cm?1）区域也出现轻微位移，表明TGase处理后蛋白链间相互作用发生改变，促进了分子间交联和三维网络结构的形成。
蛋白溶解性：在所有测试pH条件下，核桃蛋白的氮溶解指数（NSI）均高于冷榨核桃粕，在pH 9.0时达到最大溶解性96.21%。
起泡性与泡沫稳定性：核桃蛋白的起泡能力和泡沫稳定性均优于冷榨核桃粕，在pH 9.0时起泡能力（FC）和泡沫稳定性（FS）分别达91.00%和86.44%。这主要归因于TGase催化形成的ε-(γ-谷氨酰基)-赖氨酸共价交联构建了高强度三维网络，在气液界面形成致密弹性蛋白膜，抑制气体逸出。
乳化性与乳化稳定性：核桃蛋白的乳化性能显著高于冷榨核桃粕（p < 0.001），乳化活性（EA）和乳化稳定性（ES）分别达88.64%和90.57%。TGase交联增强了蛋白的吸水性和吸油性，使更多肽链吸附于水油界面，从而改善乳化能力。
吸油性与吸水性：核桃蛋白的吸油性和吸水性分别达5.26和6.03 g/g，显著高于冷榨核桃粕（p < 0.001）。TGase交联促进致密三维蛋白网络的形成，增强了蛋白结合和保留水与脂质的能力。
抗氧化活性：核桃蛋白的抗氧化活性随蛋白浓度增加而逐渐升高，在6 mg/mL时达到最大值9.0 U/mL，表明超声辅助酶解结合TGase交联改善了核桃蛋白的结构，增强了其功能特性。
五、讨论与结论
本研究从冷榨核桃粕中制备核桃蛋白，最优条件下蛋白提取率达82.42%，高于碱提法（43.2%）、超声辅助提取法（71.07%）和反胶束提取法（67.29%）；膜分离结合酸醇沉淀使蛋白沉淀率达89.13%，同时降低色素含量并提高蛋白纯度，蛋白纯度接近已报道的最高值约90%，高于超声辅助提取法（72.69%）。超声处理破坏了蛋白的有序聚集体并促进蛋白展开，为酶解和交联提供了适宜结构，形成了相对均匀的蛋白网络，与SEM观察到的疏松柔韧结构一致。FTIR结果也证实了TGase处理后蛋白构象的变化。交联后的核桃蛋白表现出良好的持水性、持油性、起泡性和乳化性等功能特性。
该研究提出的方法为改善核桃蛋白回收率和功能特性提供了一条简便且可规模化放大的途径。研究结论表明，该方法能有效提高核桃蛋白的提取效率和功能特性，为核桃蛋白配料和肽类功能性食品的开发提供了理论支持。
然而，研究仍存在若干局限性：酶改性核桃蛋白的潜在致敏性和食品安全性需要系统研究；其在不同食品体系（如蛋白饮料、植物基肉类似物和烘焙产品）中的应用特性有待评价；未来可研究不同储存温度、储存时间和氧气暴露条件下的储存稳定性，采用过氧化值（PV）和硫代巴比妥酸反应物（TBARS）等指标进行评价；此外，还需基于中试规模生产数据进行全面的技术经济分析，以进一步评估改进工艺的放大潜力和工业可行性。
