《Food Science & Nutrition》：Effects of Short-Term Energy Limitation at Different Levels With Normal Protein Intake on Hepatic Lipid Metabolism and the Gut Microbiota in Overweight/Obese Mice
编辑推荐：
摘要专业翻译
本研究探讨了分级短期能量限制（EL）联合正常蛋白摄入对超重/肥胖小鼠肝脏脂质代谢及肠道菌群的性别特异性影响。研究人员将小鼠分为正常对照组（NC）、高脂饮食模型组（MC）以及接受20%、30%或40%能量限制的干预组（每组n=8）。对所有小鼠进行了
摘要专业翻译
本研究探讨了分级短期能量限制（EL）联合正常蛋白摄入对超重/肥胖小鼠肝脏脂质代谢及肠道菌群的性别特异性影响。研究人员将小鼠分为正常对照组（NC）、高脂饮食模型组（MC）以及接受20%、30%或40%能量限制的干预组（每组n=8）。对所有小鼠进行了血液生化、肝脏生化、组织学、肝脏代谢组学及粪便菌群群落基因组学分析。与NC组相比，雄性和雌性MC小鼠均出现不同程度的胰岛素抵抗（IR）、血脂异常及性激素调节紊乱。然而，仅在雄性小鼠中检测到肝脏脂质代谢紊乱，并伴随关键脂质代谢酶及代谢物的变化；雌性小鼠仅表现出总胆固醇（TC）代谢紊乱，这与胆固醇合成限速酶HMGCR的改变相关。在正常蛋白摄入条件下，20%、30%和40%能量限制通过抑制关键脂质合成酶DGAT的表达及ACC和HMGCR的活性，降低了超重/肥胖雄性小鼠的肝脏甘油三酯（TG）和总胆固醇合成（p<0.05）。仅在30%能量限制组检测到对脂解酶CPT1和CYP7A1的影响（p<0.05），且肝脏代谢物谱随能量限制程度而变化。在雌性小鼠中，仅40%能量限制通过抑制HMGCR表达和酶活性显著降低总胆固醇合成（p<0.05）。此外，无论性别如何，短期能量限制（所有水平）联合正常蛋白摄入均降低了超重/肥胖小鼠肠道厚壁菌门/拟杆菌门比值（p<0.05）。综上所述，分级短期能量限制联合充足蛋白摄入对超重/肥胖小鼠的肝脏脂质代谢和肠道菌群产生差异化影响，且存在显著的性别特异性差异。
论文解读
一、研究背景与目的
全球肥胖患病率在过去四十年间翻了一番，给公共卫生带来沉重负担。超重/肥胖与肝脏脂质代谢紊乱密切相关，后者是代谢综合征（包括胰岛素抵抗和非酒精性脂肪性肝病）的核心病理基础。能量限制（EL）是改善超重/肥胖肝脏脂质代谢紊乱的经典非药物干预手段，其效果随限制程度而异。然而，现有研究多聚焦于单一水平的能量限制方案，缺乏对分级能量限制方案的比较及其机制的系统阐明。能量限制对肝脏脂质代谢的影响还具有性别依赖性，既往研究显示40%能量限制可降低雄性和雌性超重/肥胖大鼠的肝脏脂肪含量，但仅在雄性中升高血浆总胆固醇。此外，肠道菌群作为“虚拟器官”，通过肠-肝轴及其代谢产物调节肝脏脂质代谢，而不同膳食模式深刻影响肠道菌群的组成、功能与代谢活性。然而，多数研究未将性别和能量限制强度同时作为变量考量，导致性别差异是否调控不同能量限制强度下肝脏脂质代谢、肠道菌群及代谢组的改变仍不清楚。鉴于膳食蛋白可通过氨基酸感应和糖异生直接调节肝脏从头脂质合成和脂肪酸氧化，并通过肠-肝轴重塑肠道菌群间接调节肝脏脂质稳态，本研究在高脂饮食诱导的超重/肥胖小鼠中施加蛋白摄入一致的分级能量限制干预，利用非靶向代谢组学和16S rDNA测序技术，系统探究不同能量限制水平对肝脏TG/胆固醇代谢及肠道菌群的影响及机制，包括性别特异性差异。
二、主要关键技术方法
研究人员从扬州大学比较医学中心获取96只8周龄SPF级C57BL/6J小鼠（雄性48只、雌性48只），单笼饲养、雌雄分笼。适应1周后，每性别各8只随机分配至正常对照组（NC），其余小鼠接受高脂饮食（HFD）诱导肥胖。当平均体重超过同性别NC组10%时判定模型建立成功，雄性需9周、雌性需11周。超重/肥胖小鼠按性别分层后随机分为8组（每组n=8），包括雄性和雌性MC组（继续HFD）及三个雄性和三个雌性EL干预组（分别接受20%、30%、40%能量限制）。主要技术方法包括：自动化临床生化分析仪检测血清糖脂代谢参数；ELISA试剂盒检测血清胰岛素、胰高血糖素、雌二醇、睾酮及肝脏脂质代谢相关酶；H&E染色及NAFLD活动度评分（NAS）系统进行肝脏组织学评估；基于UHPLC-Q Exactive HF-X高分辨质谱的非靶向肝脏代谢组学分析；基于NovaSeq6000平台的16S rDNA扩增子测序进行肠道菌群分析；线性混合效应模型、双因素方差分析及稳健双因素方差分析进行统计处理。
三、研究结果
3.1 体重、脂肪含量与摄食量
诱导肥胖后，MC组体重显著高于NC组。分级能量限制后，两性体重均显著下降并与NC组相当。MC组白色脂肪组织重量雄性为NC组的4.77倍、雌性为6.17倍，表明雌性对高脂饮食的脂肪蓄积反应更明显。所有水平能量限制均显著降低两性白色脂肪组织重量。MC组总能量和脂肪摄入显著高于其他组，NC组碳水化合物摄入显著高于其他组，各EL组间蛋白摄入无显著差异。
3.2 血清生化指标
与NC组相比，MC组表现出显著胰岛素抵抗，雄性HOMA-IR指数为NC组的2.33倍、雌性为1.93倍，且性别差异显著。所有EL干预均显著逆转超重/肥胖小鼠的胰岛素抵抗。MC组血清TG、TC和LDL水平显著升高，EL干预整体改善这些指标；但雌性小鼠仅在40% EL后TG、TC和LDL才显著降低。性激素方面，雄性MC小鼠睾酮显著下降，雌性MC小鼠雌二醇显著升高，30%和40% EL均将激素水平恢复至与NC组相当。
3.3 肝脏组织学
H&E染色显示雄性MC组出现显著肝脏脂肪变性，三个EL组均大幅减轻。雌性各组均未见明显脂肪变性。雄性和雌性MC小鼠的脂肪变性和气球样变评分均显著高于其他组，且MC雄性显著高于MC雌性。MC小鼠总NAS评分显著高于相应EL组，雄性（6.00±0.64）显著高于雌性（2.54±1.05）。以NAS≥5为临床阈值，雄性MC小鼠符合NAFLD组织学标准。雄性MC小鼠肝脏空泡面积百分比显著大于其他组及雌性MC小鼠。
3.4 肝脏脂质含量与关键酶
与NC组相比，雄性MC小鼠肝脏TG和TC均显著升高，雌性MC小鼠仅TC显著升高、TG无明显变化。与MC组相比，三个雄性EL组的肝脏TG和TC均显著降低，30%和40% EL组达到NC组水平；雌性小鼠仅40% EL显著降低TC。酶学分析显示，雄性MC小鼠DGAT含量显著升高、pACC/ACC和pHMGCR/HMGCR比值显著降低；雌性MC小鼠pACC/ACC比值显著升高、pHMGCR/HMGCR比值显著降低。与MC组相比，两性所有EL组的pACC/ACC和pHMGCR/HMGCR比值均显著升高，雄性在30% EL、雌性在40% EL时增幅最大。雄性三个EL组DGAT含量均显著降低，CPT1和CYP7A1的显著变化仅见于雄性30% EL组。
3.5 肝脏代谢组学
质量控制显示数据重复性良好。OPLS-DA模型显示各组间代谢谱清晰分离。经严格筛选（VIP>1，|log?(FC)|>1，FDR<0.05）后，仅在涉及四个雄性组的比较中检测到显著差异代谢物。雄性各EL组中，肝脏葡萄糖均随血糖同步下降；L-半胱氨酸在所有雄性EL组中下调，可能削弱其对HMGCR的保护作用从而减少胆固醇合成；油酸、十六碳二酸和3-羟基吡啶甲酸升高反映肝脏TG分解增强；3′-AMP仅在20% EL特异性上调，反映能量限制下肝脏分解代谢增强；赤藓糖仅在40% EL下调，提示磷酸戊糖途径通量及NADPH供应减少。雌性小鼠相对于MC组未检测到显著肝脏代谢组改变。
3.6 肠道菌群分析
PCoA显示各组间群落结构明显分离，全局ADONIS检验表明组别因素解释49.8%的群落变异。α多样性方面，雄性各EL组与MC组无显著差异；雌性40% EL组四个多样性指数均显著降低。厚壁菌门、拟杆菌门和脱硫杆菌门为优势菌门。与NC组相比，两性MC小鼠厚壁菌门丰度显著升高、拟杆菌门显著降低，F/B比值显著升高，且雄性MC（7.53）显著高于雌性MC（6.30）。与MC组相比，雄性20% EL组厚壁菌门丰度显著降低，随后随EL强度增加逐渐恢复；雌性各EL组厚壁菌门与MC组无显著差异。脱硫杆菌门方面，仅雌性MC小鼠较NC组显著升高；与MC组相比，雄性仅40% EL组、雌性三个EL组均显著升高。
四、讨论与结论
高脂饮食诱导的超重/肥胖小鼠出现胰岛素抵抗，雄性较雌性更严重。雄性MC小鼠肝脏TG和TC显著蓄积并伴随血浆TG、TC和LDL升高，与胰岛素抵抗状态一致；雌性MC小鼠肝脏TG无显著变化，可能与雌二醇升高通过雌激素受体α促进肝脏TG和TC组装分泌、维持肝内脂质基础水平有关，这也解释了雌性MC小鼠肝TG不变但血清TG显著升高的现象。雌激素偏好促进皮下脂肪储存而雄激素促进内脏脂肪积累，部分解释了雌性MC小鼠皮下脂肪比例增幅更大的现象。
机制层面，肝脏TG合成主要由DGAT和ACC介导，分解主要依赖CPT1介导的线粒体β-氧化；肝脏TC代谢由合成限速酶HMGCR和分解限速酶CYP7A1共同调节。ACC和HMGCR的活性主要通过磷酸化调控，pACC/ACC和pHMGCR/HMGCR比值升高代表酶失活从而抑制合成。雄性小鼠所有EL组均显示DGAT蛋白水平显著降低、ACC和HMGCR活性受抑，30% EL时变化最大，表明TG/TC合成被显著抑制；分解酶变化仅见于30% EL组，CPT1上调、CYP7A1下调，虽不利于胆固醇分解，但合成抑制占主导，解释了雄性30% EL改善最显著。雌性小鼠40% EL组HMGCR活性最低，胆固醇合成抑制最大，对应40% EL改善最优。
代谢组学层面，雄性小鼠能量限制下肝脏葡萄糖下降提示肝糖消耗加速且超过糖异生补充能力；L-半胱氨酸下调削弱其对HMGCR的保护作用，减少胆固醇合成；油酸等代谢物升高反映TG分解增强；3′-AMP上调间接反映分解代谢增强；赤藓糖下调提示磷酸戊糖途径通量减少。雌性小鼠无显著代谢组改变，与能量限制下肝脏脂质水平不变一致，凸显了肝脏对超重/肥胖反应的性别特异性。
肠道菌群方面，高脂饮食诱导的超重/肥胖小鼠两性均表现F/B比值显著升高。所有EL组的F/B比值相对MC组下降，但随EL强度增加呈上升趋势，提示能量和宏量营养素摄入对厚壁菌门和拟杆菌门存在复杂而相反的效应。脱硫杆菌门对高脂饮食的反应存在性别差异，仅雌性MC小鼠显著升高，短期限能联合正常蛋白摄入在多数小鼠中显著增加脱硫杆菌门丰度，提示肠道硫代谢稳态受到干扰。
研究结论：高脂饮食诱导的超重/肥胖破坏小鼠肝脏脂质代谢和肠道菌群，雄性改变更为显著。短期能量限制联合正常蛋白摄入通过调节肝脏TG/胆固醇合成与分解改善这些紊乱，雄性改善更明显，并降低超重/肥胖小鼠肠道F/B比值。研究局限性包括：C57BL/6J小鼠高脂饮食增重倾向存在变异，仅80%成为超重/肥胖且未细分亚组；EL饮食与HFD宏量营养素组成不同，效果应视为热量限制与碳水化合物/脂肪比例改变的综合效应；以NC小鼠为参照可能混淆EL直接效应与体重下降的继发效应；未同步雌性发情周期；组学分析每组仅5只小鼠可能限制统计效能。
