《JOURNAL OF FOOD SCIENCE》：Microbiological Quality of Roasted Coffee and Survival Dynamics of Dry-Inoculated Bacteria During Storage
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本研究评估了巴西市售的78份烘焙咖啡样品（包括整豆和研磨产品）的微生物质量，并调查了具有食品安全重要性的细菌物种在储存期间于烘焙研磨咖啡中的存活情况。尽管所有样品均符合巴西法规要求，但烘焙咖啡呈现出多样化的微生物谱，包括腐败微生物、大肠菌群、嗜温性细菌和需氧嗜
本研究评估了巴西市售的78份烘焙咖啡样品（包括整豆和研磨产品）的微生物质量，并调查了具有食品安全重要性的细菌物种在储存期间于烘焙研磨咖啡中的存活情况。尽管所有样品均符合巴西法规要求，但烘焙咖啡呈现出多样化的微生物谱，包括腐败微生物、大肠菌群、嗜温性细菌和需氧嗜温性产芽孢菌。与此相对，沙门氏菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌芽孢和嗜热性产芽孢菌均未被检出。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱（MALDI-TOF）分析表明，芽孢杆菌属（Bacillus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）物种占主导地位，其中包括肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis）等机会性致病微生物。干燥接种挑战试验表明，在真空包装并于25°C下储存长达42天（超过建议的开封后保质期）的烘焙研磨咖啡中，上述两种细菌均保持存活。Weibull模型拟合表明存活曲线拟合良好，并揭示了不同微生物之间存活行为的显著差异。尽管在低水分活度条件下观察到细菌持续存活，但在整个储存期间，使用热水冲泡咖啡后，两种微生物均降至不可检出水平。
**烘焙咖啡的微生物质量与储存期间细菌存活动态：一项基于市售样品的系统评估**
**一、研究背景与问题提出**
咖啡是全球最重要的饮品之一，巴西作为全球最大的咖啡生产国，其咖啡产量约占全球总量的35%。咖啡果实（咖啡樱桃）在收获后经加工处理，所得种子经过烘焙后以整豆或研磨咖啡形式进入市场销售。既往研究主要聚焦于咖啡的微生物多样性以及微生物代谢产物对咖啡品质的影响，而针对食源性致病菌的研究仍然十分有限。
另一方面，已有研究表明咖啡生产环境中可能藏匿多种微生物，这些微生物除了污染产品外，还可能因形成受污染的粉尘和气溶胶而对从业人员构成风险。尤其值得关注的是，在可可粉和瓜拉纳粉等其他同样经历发酵和烘焙加工的低水分活度食品中，已证实不同种类的具有食品和临床重要性的细菌能够污染产品。这一发现进一步凸显了深入调查烘焙咖啡微生物谱的必要性。更为关键的是，据研究人员所知，此前尚未有针对潜在致病微生物在烘焙咖啡储存期间及后续饮品制备过程中存活情况的专门挑战试验。基于上述研究空白，本研究旨在评估巴西圣保罗州坎皮纳斯市市售烘焙研磨咖啡和整豆咖啡的微生物质量，并通过将样品中分离的致病菌和腐败菌干燥回接到烘焙研磨咖啡样品中，评估其持久存活能力。
**二、研究内容与重要意义**
本研究对来自巴西20个主要商业品牌的78份烘焙咖啡样品（涵盖26种不同产品，每种产品取3个独立生产批次）进行了系统的微生物质量评估，并在此基础上选取从样品中分离的肺炎克雷伯菌（Klebsiella pneumoniae）和表皮葡萄球菌（Staphylococcus epidermidis），采用干燥接种方法将其回接到烘焙研磨咖啡基质中，在真空包装、25°C条件下储存42天，模拟环境储存条件并超出建议的30天开封后保质期，以系统评估其存活动态。此外，研究人员还通过热水冲泡试验评估了咖啡制备过程对这两种微生物的灭活效果。
本研究的重要意义在于：首次通过挑战试验系统揭示了潜在机会性致病菌在烘焙咖啡这一低水分活度食品基质中的长期存活能力，为咖啡行业在收获后加工、研磨、包装及流通环节的卫生管理和危害分析提供科学依据，同时证实了热水冲泡过程能够有效消除活菌细胞，为消费者风险评估提供了关键数据。
**三、主要关键技术方法**
在微生物质量分析方面，研究人员采用稀释平板法对78份样品进行多项微生物指标检测，包括霉菌和酵母计数（DG18培养基，25°C培养5天）、金黄色葡萄球菌计数（Baird-Parker琼脂，35°C培养48小时，可疑菌落经MALDI-TOF MS确认）、大肠菌群和大肠杆菌计数（Petrifilm 6404板，35°C培养24–48小时）、嗜温性需氧细菌计数（PCA琼脂，35°C培养48小时）、嗜温性产芽孢菌和蜡样芽孢杆菌芽孢计数（80°C热处理10分钟后分别于TGE琼脂和MYP琼脂培养）以及嗜热性需氧产芽孢菌计数（煮沸30分钟后于DTA琼脂55°C培养72小时）。沙门氏菌检测采用BPW预增菌后进行RVS和MKTTn选择性增菌，划线于XLD和亮绿琼脂。细菌分离株的鉴定采用MALDI-TOF MS，依据质谱得分进行属种水平鉴定。在挑战试验中，采用同源载体干燥接种法，将待试菌株的细胞悬液接种至烘焙研磨咖啡载体，干燥后以10:90比例与UV处理过的烘焙研磨咖啡混合，真空密封后于25°C储存42天。存活曲线采用Weibull模型进行拟合，使用GInaFiT软件完成模型参数估计。咖啡冲泡采用常规滴滤法，使用商业一次性纸质滤纸和沸水进行。
**四、主要研究结果**
**4.1 市售烘焙咖啡的微生物质量概况**
研究结果显示，所有78份样品均未检出蜡样芽孢杆菌芽孢、嗜热性需氧产芽孢菌、大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和沙门氏菌，全部符合巴西法规（ANVISA 2019）关于此类产品中沙门氏菌和大肠杆菌不得检出的要求。然而，样品仍呈现多样化的微生物污染谱：3个整豆咖啡品牌检出霉菌和酵母（1–1.1 log CFU/g）；嗜温性需氧细菌在3份整豆样品（0.9–1.9 log CFU/g）和8份研磨样品（0.3–2.2 log CFU/g）中检出；3份研磨咖啡样品中检出总大肠菌群（0.7–1 log CFU/g）；嗜温性需氧产芽孢菌在4份整豆样品（0.4–0.9 log芽孢/g）和7份研磨样品（0.4–2.4 log芽孢/g）中检出，是所分析微生物类群中检出率和污染水平最高的。
**4.2 细菌分离株鉴定结果**
MALDI-TOF MS共鉴定出9个细菌属共计56株分离株，芽孢杆菌属（Bacillus）和葡萄球菌属（Staphylococcus）占主导地位。在物种水平上，18个已鉴定物种中，沃氏葡萄球菌（Staphylococcus warneri，21.43%）、地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis，14.29%）和枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，10.71%）最为常见。值得关注的是，肠杆菌科成员中检出了肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae）和Kosakonia cowanii，其中肺炎克雷伯菌属于大肠菌群中的机会性致病菌。
**4.3 干燥接种挑战试验与存活动态**
将表皮葡萄球菌（S. epidermidis, LMQA-RoaCoff-02）和肺炎克雷伯菌（K. pneumoniae, LMQA-RoaCoff-01）干燥接种至烘焙研磨咖啡后，在真空包装、25°C条件下储存的42天内，两种微生物始终保持存活。Weibull模型对两组存活数据均显示出良好的拟合效果（R
2均为0.96）。两种细菌达到首个对数减少所需时间（δ值）相近，均约为15天，相当于产品建议开封后保质期的近一半。然而，存活曲线形状参数（β）揭示了截然不同的灭活动力学行为：表皮葡萄球菌呈现“肩型”灭活曲线（β > 1），而肺炎克雷伯菌呈现“拖尾型”曲线（β < 1），后者表现出更强的抗灭活能力。模型外推的4个对数减少所需时间（t
4）显示，肺炎克雷伯菌（约124天）约为表皮葡萄球菌（约37天）的3倍。
**4.4 咖啡冲泡灭活效果**
尽管两种细菌在干燥储存条件下表现出显著的耐受性，但在整个42天储存期的各个采样时间点，采用沸水滴滤冲泡咖啡后，两种微生物在咖啡滤液中均未被检出（检出限为10 CFU/g），表明热水冲泡过程能够有效消除活菌细胞，且未观察到储存过程中诱导产生耐热性的证据。
**五、讨论与结论**
本研究揭示了尽管烘焙咖啡的水分活度较低（整豆咖啡a
w约为0.487，研磨咖啡a
w约为0.427），且pH值处于酸性范围（约5.7–5.8），但产品仍可携带包括机会性致病菌在内的多种微生物，其中产芽孢菌的污染水平最高，这与低水分活度条件不利于营养细胞维持而有利于芽孢存活的理化特性一致。研究结果与可可粉、瓜拉纳粉等其他发酵并热处理低水分活度食品中报道的微生物污染情况相呼应。季节变化、地理来源和收获后加工方式是决定咖啡微生物群及其最终产品微生物学特征的主要因素。尽管本研究未沿生产链追溯污染源，但既往危害分析与关键控制点（HACCP）研究一致将烘焙后的处理、研磨和包装环节确定为应重点评估的关键控制点。
**研究结论**：最终得出结论，尽管烘焙研磨咖啡和整豆咖啡样品呈现不同程度的污染，但所有样品均符合巴西法规（ANVISA 2019）要求，沙门氏菌和大肠杆菌均未检出。尽管水分活度较低，烘焙咖啡仍展现出多样化的微生物污染谱，包括以营养细胞或芽孢形式检出的腐败菌和机会性致病菌。机会性致病微生物的检出从卫生学角度具有重要意义，特别是考虑到免疫功能低下人群等易感群体，并凸显了良好操作规范的重要性，尤其在销售环节。此外，肺炎克雷伯菌和表皮葡萄球菌分离株干燥回接到室温储存的烘焙研磨咖啡中后，其存活时间超过了建议的开封后保质期。然而，在测试条件下，两种微生物在冲泡咖啡滤液中均未能回收，微生物计数始终低于检出限。
