MRP8-Cre转基因小鼠抵抗饮食诱导肥胖不依赖于中性粒细胞：Serpine1/PAI-1与Ap1s1缺失的脱靶效应

《European Journal of Immunology》：MRP8-Cre Transgenic Mice Are Resistant to Weight Gain and Diet-Induced Obesity Independently of Neutrophils

　　

肥胖是代谢综合征、癌症、糖尿病及其他疾病的主要风险因素。合并症的发生与全身性和脂肪组织（adipose tissue, AT）炎症相关，其特征为脂肪组织中存在巨噬细胞和中性粒细胞。中性粒细胞在驱动脂肪组织炎症和病理中的作用研究尚不充分，可能具有治疗前景。MRP8Cre转基因小鼠常被用于研究中性粒细胞功能。近期一项报告表明，MRP8Cre转基因的插入导致Ap1s1（适配体相关蛋白复合物1亚基sigma 1，Adaptor Related Protein Complex 1 Subunit Sigma 1）和Serpine1的全身性缺失，后者编码促肥胖因子——纤溶酶原激活物抑制剂-1（plasminogen activator inhibitor-1, PAI-1）。本研究中，研究人员展示了MRP8Cre转基因小鼠在标准普通饮食下体重低于同窝对照小鼠。此外，在喂食致肥胖的高脂饮食（high-fat diet, HFD）后，这些小鼠对体重增加、脂肪组织肥大、葡萄糖代谢的全身性失调、巨噬细胞向脂肪组织的浸润以及肝脂肪变性具有抵抗性。机制上，该表型不依赖于中性粒细胞或骨髓来源细胞，也与小鼠的性别、年龄、HFD喂养持续时间、处理起始时间、饲养设施或小鼠的原始来源无关。无论饮食如何，MRP8Cre小鼠代谢器官中Serpine1/PAI-1和Ap1s1的表达均全面降低，从而表型复制了先前关于PAI-1缺失对小鼠肥胖具有保护作用的报道。研究人员的发现表明，由于观察到的脱靶效应，MRP8Cre小鼠在肥胖或代谢研究中的适用性有限，并强调了使用转基因小鼠时需要相应的对照，如仅Cre对照（Cre-only controls）或使用独立的Cre系进行涉及Cre/loxP系统的研究。

**论文解读**

**一、研究背景与科学问题**

肥胖是2型糖尿病、癌症、心血管疾病及血栓性疾病的主要风险因素。肥胖相关合并症的病因涉及慢性、全身性低度炎症，其源头在于体重增加过程中脂肪组织（adipose tissue, AT）的功能障碍。AT炎症由多种因素引发，包括脂肪细胞应激与死亡、纤维化细胞外基质（extracellular matrix, ECM）对细胞的机械应力以及脂肪酸代谢失调。这种炎症损害AT的代谢状态和线粒体功能、脂肪生成和脂质合成，进而导致脂质在肝脏和骨骼肌等代谢器官中异位积累。单核细胞通过局部释放的危险信号和趋化因子（如CCL2）被招募至AT，分化为AT巨噬细胞（adipose tissue macrophages, ATMs），后者是AT炎症的关键促进者，导致AT胰岛素抵抗及下游肥胖相关病理。巨噬细胞向AT的浸润受纤维蛋白沉积以及促凝血和抗纤溶分子（如凝血因子XIII-A转谷氨酰胺酶FXIII-A和PAI-1）的促进，这一过程被称为血栓炎症（thromboinflammation），可加剧肥胖相关的代谢功能障碍并促进体重增加。

中性粒细胞在血栓性疾病和AT炎症中发挥重要作用。体重增加后数天内中性粒细胞即浸润AT，通过促进促炎性巨噬细胞招募驱动AT炎症。中性粒细胞来源的活性氧（reactive oxygen species, ROS）和中性粒细胞胞外陷阱（neutrophil extracellular traps, NETs）也参与肥胖相关炎症。因此，深入理解中性粒细胞作为肥胖相关病理促进因子的生物学功能具有重要的治疗前景。MRP8Cre转基因小鼠系通过随机基因组整合MRP8-Cre-ires-eGFP盒产生，由人S100A8（myeloid-related protein 8, MRP8）启动子驱动Cre重组酶和eGFP的表达。该品系基因删除效率高且对中性粒细胞具有高度特异性，因而被广泛用于中性粒细胞功能研究。然而，该工具的局限性逐渐显现：MRP8Cre转基因纯合子对小鼠具有致死性，原因是转基因插入至5号染色体导致Serpine1（编码PAI-1）基因完全缺失和Ap1s1（编码适配体相关蛋白复合物1亚基sigma 1）部分缺失。PAI-1通过抑制纤溶维持血凝块稳定，其功能与血栓炎症及肥胖相关病理的加剧密切相关。在肥胖患者和小鼠中，AT和肝脏中PAI-1表达升高导致全身PAI-1水平升高；而通过遗传或药理学手段干扰PAI-1可导致小鼠对体重增加的抵抗。人类SERPINE1/PAI-1杂合性与寿命延长和较低糖尿病发病率相关。基于上述背景，研究人员系统评估了MRP8Cre转基因小鼠的代谢表型及其在肥胖研究中的适用性。

**二、研究概述与重要意义**

研究人员发现，MRP8Cre杂合子转基因小鼠在标准饮食下体重低于同窝对照小鼠，在HFD喂养下对体重增加、AT肥大、葡萄糖代谢失调、巨噬细胞浸润和肝脂肪变性均表现出显著抵抗性。通过骨髓移植实验和Ms4a3Cre品系验证，研究人员证明该保护表型不依赖于中性粒细胞或骨髓来源细胞。MRP8Cre小鼠代谢器官中Serpine1/PAI-1和Ap1s1的表达显著降低，表型复制了PAI-1缺失对肥胖的保护作用。该研究揭示了MRP8Cre小鼠在肥胖和代谢研究中的脱靶效应，对其在这些领域的适用性提出警示，并强调了Cre/loxP系统研究中设置适当对照（如Cre-only对照或独立Cre系验证）的必要性。

**三、关键技术方法**

两个独立实验室（Wculek实验室于IRB Barcelona，Kaartinen实验室于McGill University）分别开展研究。使用的小鼠品系包括：C57BL/6N野生型、B6.Cg-Tg(S100A8-cre.-EGFP)1Ilw（MRP8Cre，分别获赠自A. Hidalgo [CNIC, Madrid, Spain]或购自The Jackson Laboratory）、Uqcrq1.1Ncdl（Uqcrq^f/f）、Ms4a3^em2(cre)Fgnx（Ms4a3Cre，获赠自F. Ginhoux）和FXIII-A^flox/flox（F13a1^f/f）小鼠，均以同窝对照进行比较。主要方法包括：60% kcal高脂饮食（HFD）喂养诱导肥胖模型（起始年龄为4周龄或8周龄）；致死性辐照后骨髓移植实验；Promethion Core系统进行代谢和行为表型分析；时域核磁共振（TD-NMR）分析身体成分；腹腔葡萄糖耐量试验（GTT）；血浆生化分析（甘油三酯、胆固醇、葡萄糖、ALT）；组织学分析包括F4/80免疫组化（巨噬细胞标志物）、Oil Red O染色（脂质沉积）、HE染色及脂肪细胞大小定量；流式细胞术分析免疫细胞群、ROS水平和eGFP表达；qPCR检测基因表达；Seahorse分析中性粒细胞氧化爆发能力；以及中性粒细胞mRNA测序和生物信息学分析。

**四、主要研究结果**

**4.1 MRP8Cre转基因小鼠体重降低并抵抗HFD诱导的体重增加，且不受饲养条件、floxed等位基因或骨髓来源细胞的影响**

8周龄标准饮食的MRP8Cre杂合子雄性和雌性同窝小鼠体重低于野生型对照。携带Uqcrq^f/f floxed等位基因的MRP8Cre Uqcrq^f/f小鼠同样表现出较低体重，且该差异随时间维持。胫骨长度在各组间基本相等，表明小鼠生长基本未受影响。HFD喂养后，无论是否存在floxed等位基因，MRP8Cre雄性和雌性小鼠的体重增加均显著低于对照。骨髓移植实验表明，仅骨髓来源细胞携带MRP8Cre转基因并不降低HFD喂养小鼠的体重增加。使用Ms4a3Cre（另一种中性粒细胞靶向Cre品系）的Uqcrq^f/f小鼠也未表现体重保护。此外，MRP8Cre中性粒细胞的丰度、转录组、成熟相关蛋白表达、呼吸爆发能力和ROS产生均未改变。Kaartinen实验室使用不同来源MRP8Cre小鼠与F13a1^f/f floxed等位基因以及不同HFD起始年龄独立验证了上述结果。综合表明，MRP8Cre小鼠抵抗HFD诱导肥胖的表型源于转基因的整体插入而非中性粒细胞。

**4.2 MRP8Cre转基因小鼠尽管食物摄入量相当但表现出改善的全身代谢健康**

标准饮食的MRP8Cre Uqcrq^f/f小鼠瘦体重无变化，雌性脂肪量略低，两性在GTT中均表现出血糖清除加速趋势。HFD喂养后，MRP8Cre杂合子小鼠脂肪量显著减少约50%，而瘦体重基本不受影响，提示生长正常但脂肪积累特异性减少。雄性小鼠血浆胆固醇和葡萄糖浓度显著降低，两性GTT中血糖清除均改善。值得注意的是，无论标准饮食还是HFD喂养，MRP8Cre小鼠的食物和饮水消耗量与对照相当甚至更高，血浆甘油三酯浓度也无差异。代谢笼分析显示，MRP8Cre小鼠的自愿运动量与对照相似，但尤其雌性MRP8Cre小鼠的能量消耗率升高，这可能是其抵抗HFD诱导体重增加的原因之一。

**4.3 HFD喂养的MRP8Cre转基因小鼠脂肪沉积减少伴随白色脂肪组织和肝脏健康改善**

标准饮食下MRP8Cre转基因小鼠的脂肪垫重量较对照轻度降低。HFD喂养后，雄性和雌性MRP8Cre及MRP8Cre Uqcrq^f/f小鼠的附睾/性腺周围白色脂肪组织（eWAT/pgWAT）和腹股沟皮下白色脂肪组织（iWAT）脂肪垫显著小于对照，脂肪细胞尺寸也显著减小。雄性HFD喂养MRP8Cre小鼠eWAT和iWAT中F4/80⁺和CD64⁺巨噬细胞数量及冠状结构（crown-like structures, CLS）形成均减少，单核细胞趋化因子Ccl2表达降低。胰岛素敏感基因和胰岛素受体信号通路相关基因在MRP8Cre小鼠eWAT中表达升高，脂联素（Adipoq）表达升高而瘦素（Lep）表达无变化，提示WAT胰岛素敏感性和代谢健康改善。iWAT中Dio2（WAT米色化中枢调节因子）表达降低，UCP1在各基因型中均不可检测，表明无WAT米色化的明显迹象。肝脏方面，雄性HFD喂养MRP8Cre Uqcrq^f/f小鼠肝脏脂质积累（Oil Red O染色）显著减少，血浆丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平降低。雌性仅表现出轻度改善，可能与雌性本身对HFD诱导肝脏病理的已知保护作用有关。非代谢器官（如肺）重量基本未受影响。

**4.4 HFD喂养下MRP8Cre转基因小鼠代谢器官中Serpine1（PAI-1）表达降低**

MRP8Cre转基因插入导致Serpine1和Ap1s1杂合性缺失。研究人员利用CZ CELLxGENE Discover平台查询发现人SERPINE1在肝脏和AT各细胞类型中广泛表达，无明确组织或细胞趋向性。在对照小鼠中，HFD喂养后iWAT中Serpine1和Ap1s1表达上调。然而，无论标准饮食还是HFD喂养，MRP8Cre小鼠eWAT、iWAT和肝脏中Serpine1和Ap1s1的表达均显著降低（超过50%）。PAI-1/Serpine1功能受损被报道可降低肥胖小鼠和人类的肥胖程度、减少体重增加和肥胖相关病理。脂肪细胞中PAI-1/Serpine1缺失可改善脂肪细胞胰岛素敏感性和葡萄糖摄取，PAI-1/Serpine1缺陷脂肪细胞对TNFα诱导的去分化和胰岛素信号抑制具有抵抗性。Ap1s1的纯合缺失在小鼠和人类中具有胚胎致死性，但其相关亚型Ap1s2完全缺失被报道可损害脂肪细胞分化。因此，MRP8Cre小鼠代谢器官中Serpine1表达显著降低可能是其抵抗脂肪量增加、AT肥大和恶化、巨噬细胞浸润及相关代谢综合征的主要原因，Ap1s1缺失也可能产生额外影响。

**五、讨论与结论**

本研究报道了MRP8Cre转基因小鼠对正常饮食下体重增加具有内在抵抗性，该抵抗性在过度营养诱导的代谢压力下更加明显。MRP8Cre小鼠脂肪库和其他代谢器官中Serpine1/PAI-1和Ap1s1表达降低，这很可能是由MRP8Cre转基因整合导致的两个基因杂合性缺失所致。MRP8Cre小鼠在HFD喂养下受到保护，免于体重增加、AT巨噬细胞浸润、肝脂肪变性和糖尿病，表型复制了肥胖小鼠中PAI-1受损的表型以及人类PAI-1杂合性的特征。值得注意的是，该代谢健康改善在两性中大致相等，且不依赖于floxed等位基因、饲养条件、HFD喂养起始时间，尤其不依赖于中性粒细胞。然而，其他因素也可能影响MRP8Cre/+小鼠的内在代谢表型，包括Cre或eGFP表达的脱靶效应、转基因整合导致的DNA三级结构改变及其他未知变量。由于Serpine1/PAI-1和Ap1s1在炎症性疾病、癌症、脑梗死、T细胞反应及罕见疾病（如IDEDNIK综合征）中发挥重要作用，研究人员建议在不同领域和疾病实验研究中谨慎使用MRP8Cre/+转基因小鼠模型。

研究结论：本研究主张在代谢、血栓形成或任何可能涉及Serpine1/PAI-1或Ap1s1的研究中仔细评估MRP8Cre转基因小鼠的适用性。在更广泛的层面上，研究人员的发现强调了在利用遗传小鼠模型进行实验时纳入适当对照的重要性，尤其是Cre-only对照的必要性以及依赖Cre-loxP系统的研究需在独立Cre系中验证实验结果。