《Journal of Anatomy》：Trigeminal and facial branchiomotor neurons have shared muscle targets in zebrafish larvae
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三叉神经和面神经鳃运动神经元被认为分别在第一和第二鳃弓中拥有各自独特的外周肌肉靶标。然而，它们在斑马鱼中的神经支配模式此前仅被精确追踪至受精后48小时（hours postfertilization，hpf）。在本研究中，研究人员解剖了初次摄食的斑马鱼幼鱼腹侧
三叉神经和面神经鳃运动神经元被认为分别在第一和第二鳃弓中拥有各自独特的外周肌肉靶标。然而，它们在斑马鱼中的神经支配模式此前仅被精确追踪至受精后48小时（hours postfertilization，hpf）。在本研究中，研究人员解剖了初次摄食的斑马鱼幼鱼腹侧鳃弓肌中三叉神经和面神经运动神经的最终外周目的地。通过结合多种转基因品系，研究人员发现，在约56 hpf时，面神经向前延伸至下颌间肌群（intermandibularis group of muscles），该肌群在经典定义中由三叉神经支配。有趣的是，面神经可同侧和对侧投射至这些肌肉。此外，三叉神经也在约53 hpf时向后延伸进入舌弓区域，到达舌骨间肌（interhyoideus muscles）。对面神经元的靶向消融揭示，三叉神经在受精后3至4天（days post fertilization，dpf）之间进一步向后延伸至舌骨下肌（hyohyoideus inferior muscles）。值得注意的是，即使在没有面运动神经元的情况下，这两个舌弓肌肉仍能形成神经肌肉接头（neuromuscular junctions，NMJs），表明其三叉神经支配具有功能相关性。总体而言，研究人员表明，除舌骨上肌（hyohyoideus superior）外，所有腹侧鳃弓肌肉均接受双重神经支配，而舌骨上肌仅由面神经单独支配。研究人员提出，前腹侧鳃弓肌肉的这种联合神经支配可能对其在呼吸或摄食中的协调功能至关重要。
论文解读文章
一、研究背景与科学问题
在脊椎动物中，面部和颈部肌肉由脑神经（cranial nerves）支配。脑运动神经元起源于脑干，其轴突向外周靶肌肉投射。在早期发育过程中，容纳脑运动神经元V–XII的后脑（hindbrain）会暂时性地分割为一系列菱脑节（rhombomeres）。每个菱脑节表达一组独特的调控基因，如Hox基因。这种差异性的基因表达赋予每个菱脑节内产生的脑神经节、运动神经元和神经嵴细胞（neural crest cells，NCCs）独特的节段身份。后脑的模式化通过菱脑节特异性的神经嵴细胞迁移至特定鳃弓而与鳃弓模式化紧密相连，从而在神经嵴细胞、运动神经元及其靶鳃弓之间建立了功能对应关系。
传统观点认为，三叉神经运动神经支配下颌弓肌肉，而面神经运动神经支配舌弓肌肉。例如，在斑马鱼中，三叉神经运动神经被认为支配下颌收肌（adductor mandibulae）、下颌间前肌（intermandibularis anterior）和下颌间后肌（intermandibularis posterior），而面神经支配舌骨间肌（interhyoideus）、舌骨下肌（hyohyoideus inferior）和舌骨上肌（hyohyoideus superior）。然而，此前的这些研究使用的标记方法（如抗乙酰化微管蛋白抗体或isl1:GFP转基因）均不能特异性标记某一脑神经。此外，面神经在舌弓和下颌弓中的位置仅在48 hpf之前被精确追踪过。斑马鱼幼鱼在4 dpf时获得完全功能性的摄食装置，大多数幼鱼在4至5 dpf之间开始外源性摄食。因此，对初次摄食幼鱼（4/5 dpf）的三叉神经和面神经运动神经的神经支配模式进行系统研究至关重要。
二、研究内容与主要结论
研究人员使用多种转基因品系的组合和单细胞标记技术，详细追踪了斑马鱼三叉神经和面神经向腹侧鳃弓篮延伸的时间进程。研究发现，在初始寻路过程中，三叉神经和面神经分别投射至下颌弓和舌弓。然而，随着鳃弓肌肉的出现和成熟，面神经运动神经延伸超过舌弓区域并向前延伸至下颌弓肌肉。通过使用硝基还原酶/甲硝唑介导的消融系统选择性消除面神经元，研究人员揭示了在后期发育阶段，三叉神经同样跨越下颌–舌弓边界并向后延伸至部分舌弓肌肉。这项研究发现，除舌骨上肌外，所有腹侧鳃弓肌肉均同时含有三叉神经和面神经运动轴突。舌骨上肌是斑马鱼中唯一仅由面神经单独支配的腹侧鳃弓肌肉。
三、主要关键技术方法
研究人员使用了多种转基因斑马鱼品系：isl1:GFP和isl1:mRFP标记所有运动神经元，unc45b:mCherry标记鳃弓肌肉，hoxb1a:Gal4驱动UAS:Kaede特异性标记菱脑节4来源的面神经元，UAS:NTR-mCherry用于组织特异性细胞消融。主要技术方法包括：共聚焦显微镜活体成像、Kaede光转换技术用于单侧标记面运动神经元、延时成像追踪神经延伸动态、全组织免疫组织化学检测神经肌肉接头、FIJI/ImageJ图像计算提取三叉神经运动成分、硝基还原酶/甲硝唑介导的细胞消融、以及单细胞电穿孔荧光染料标记。实验鱼品系饲养于德克萨斯大学奥斯汀分校和康奈尔大学。
四、研究结果
4.1 面神经运动神经元支配下颌弓肌肉
研究人员使用hoxb1a:Gal4;UAS:Kaede;unc:mCherry转基因品系，在4 dpf时发现面神经比此前报道的位置更靠前，其轴突已到达腹内侧下颌弓肌群——下颌间前肌和下颌间后肌，但未出现在下颌弓腹外侧的下颌收肌中。通过hoxb1a:Gal4;UAS:Kaede;isl1:mRFP品系确认了面运动轴突存在于这两个下颌弓肌肉中，并与面感觉轴突清晰区分。延时成像显示，面神经在约56 hpf时跨越下颌舌骨连接处向前内侧延伸进入下颌弓区域，在约68 hpf时进入下颌间前肌纤维。
4.2 面运动神经元可同侧或对侧到达下颌弓肌肉
通过单侧光转换标记面运动神经元，研究人员发现面轴突在所有鱼中均同侧支配舌骨间肌。然而，在跨越下颌舌骨连接处后，57.6%的鱼中面轴突延伸至对侧或同侧和对侧两侧，42.3%的鱼中仅同侧投射。单细胞电穿孔标记实验进一步证实，单个面运动神经元可向两侧下颌间后肌发送大的侧支投射，投射以同侧为主，但也可延伸至对侧肌肉。
4.3 三叉神经向后延伸至舌弓肌肉
研究人员发现三叉神经在约53 hpf时即向后延伸越过下颌间后肌到达舌骨间肌。通过FIJI图像计算，从总运动成分中减去面运动成分，推导出三叉神经运动成分。结果表明，三叉神经运动成分不仅存在于舌骨间肌中，也存在于舌骨下肌中，但舌骨上肌中无三叉神经运动成分。
4.4 硝基还原酶/甲硝唑介导的消融
研究人员确定了72 hpf至4 dpf的甲硝唑处理窗口可有效消融面神经元而不影响鳃弓肌肉模式。在该处理条件下，舌骨上肌完全失去运动神经支配，而舌骨下肌和舌骨间肌仍有运动神经支配，证实这些肌肉也接受三叉神经支配。进一步的时间分析表明，三叉神经在53 hpf进入舌骨间肌，在3至4 dpf之间延伸至舌骨下肌。
4.5 三叉神经可在舌骨间肌和舌骨下肌中形成神经肌肉接头
即使在面神经缺失的情况下，舌骨间肌和舌骨下肌仍能形成神经肌肉接头，表明三叉神经支配具有功能相关性。舌骨上肌在面神经元消融后完全失去突触前末梢。早期（24–48 hpf）和晚期（4–5 dpf）消融面神经元均不影响三叉神经向后延伸的范围，表明这是三叉神经的正常支配模式。
五、讨论与结论
本研究发现斑马鱼鳃弓肌肉神经支配中的两个主要事件：面神经向前延伸至腹内侧下颌弓肌肉，以及三叉神经支配舌骨间肌和舌骨下肌。这些发现改变了目前对腹侧鳃弓肌脑神经支配图谱的认识，表明三叉神经和面神经并不像此前认为的那样局限于下颌弓和舌弓区域内。比较解剖学证据支持这些发现：Allis在1903年和1922年对多种辐鳍鱼类的解剖描述中已记载面神经向前延伸至下颌弓区域、三叉神经向后延伸至舌弓区域，以及这些神经分支在腹侧鳃弓肌肉中的吻合。从功能角度看，下颌间后肌和舌骨间肌共同执行降低下颌和提升舌弓的功能，这些肌肉的联合神经支配可能对其协调收缩至关重要。舌骨上肌的功能是协调鳃条膜运动，与舌弓内收或下颌回缩无关，这与该肌肉仅由面神经单独支配的发现一致。
研究人员提出，初始阶段脑神经具有特定的鳃弓靶标，但在后期发育阶段，脑神经跨越鳃弓边界，共同构建来源于多个鳃弓的复合肌肉骨骼单元以完成共同的功能角色。这种重叠投射的发育调控可能涉及Hox基因的嵌套表达模式，相邻节段的神经元共享部分组合Hox编码，可能产生共同的靶向线索以促进汇聚投射。这些交叉投射在5 dpf时仍然存在，此时斑马鱼幼鱼已具备完全功能性的鳃弓肌肉骨骼系统，表明这些投射可能代表功能性正常发育状态而非错误投射。未来研究需确定在幼鱼期摄食机制转变后，这些联合投射是否得以维持。
