刺猬merbecoviruses趋同利用氨基肽酶N（APN）受体

《Nature Microbiology》：Convergent use of aminopeptidase N receptor by hedgehog merbecoviruses

　　

在野生动物中传播的冠状病毒，如欧洲和亚洲刺猬merbecoviruses（EriCoVs），构成潜在的传播风险。对病毒受体的认识可为风险评估和应对措施制定提供依据；然而，EriCoVs的功能受体尚不清楚。研究人员将刺猬氨基肽酶N（aminopeptidase N, APN）鉴定为多种EriCoVs的功能受体。对来自93个物种的APN直系同源物的分析揭示，EriCoVs具有受限的APN嗜性，主要利用刺猬APN，较小程度上利用猫科动物APN。EriCoV–APN复合物的冷冻电子显微镜（cryo-EM）分析揭示了一种不同于α-冠状病毒和δ-冠状病毒所使用的APN结合模式。功能实验表明，多种蛋白酶可以以环境和毒株依赖性方式促进EriCoV刺突蛋白（spike, S）的蛋白水解激活。靶向EriCoV受体结合结构域（receptor-binding domain, RBD）和刺猬APN的中和抗体有效阻断EriCoV假病毒进入或扩增。通过冷冻电子显微镜分析进一步阐明了靶向受体结合结构域的抗体。总之，这些发现可为merbecovirus溢出（spillover）和致病性的评估提供信息。

**刺猬merbecoviruses趋同利用氨基肽酶N受体：结构、宿主嗜性与中和抗体的系统研究**

**研究背景与目的**

在野生动物中传播的冠状病毒，例如欧洲和亚洲刺猬来源的merbecoviruses（EriCoVs），对公共卫生构成潜在威胁。此前已知merbecoviruses属病毒可利用DPP4或ACE2作为受体，但EriCoVs既不使用ACE2也不使用DPP4，其功能受体一直未知，这限制了对该类病毒跨种传播风险的评估和干预策略的开发。因此，鉴定EriCoVs的功能受体并阐明其入侵机制，对于评估其溢出风险和制定应对措施具有重要意义。该研究于《Nature Microbiology》发表，系统解决了EriCoVs受体识别与进入机制的关键问题。

**研究内容与主要结论**

研究人员通过序列分析、受体表达筛选、假病毒进入实验、冷冻电镜结构解析、蛋白酶活化分析和中和抗体研发，证明刺猬氨基肽酶N（APN）是多种EriCoVs的功能受体。该发现首次将APN受体的使用拓展至β-冠状病毒属，揭示了merbecoviruses中受体使用的趋同进化现象，为理解冠状病毒受体演化提供了新视角。

**主要关键技术方法**

研究人员从GSA和SRA数据库获取刺猬组织RNA-seq数据，组装并验证了刺猬APN等受体序列；利用VSV假病毒系统评价受体结合与进入；通过流式细胞术、pull-down和生物层干涉法定量分析相互作用；采用冷冻电镜解析了刺猬APN与EriCoV RBD复合物及抗体复合物结构；通过小鼠免疫和单B细胞分选获得单克隆抗体，并使用SPR进行表位分型；使用重组水疱性口炎病毒（rcVSV）系统评估多轮扩增。此外，人血浆样本来自北京地坛医院的随机捐献者（均获知情同意），用于交叉中和活性检测。

**研究结果**

**1. 刺猬APN是EriCoVs的受体**
研究人员分析公共基因组和S蛋白序列，发现亚洲和欧洲EriCoV形成姊妹谱系，其RBD序列与ACE2使用的NeoCoV相近，但关键受体结合残基差异显著。在HEK293T细胞中瞬时表达候选受体后，仅刺猬APN（来自东北刺猬E. amurensis）支持RU15-1和MO1毒株RBD的结合及VSV假病毒进入，而ACE2、DPP4、TMPRSS2等均不支持。进一步通过流式细胞术、pull-down和BLI确认了特异性结合。APN催化位点突变（H383A）几乎不影响受体功能，表明其作为受体的功能不依赖氨肽酶活性。结论：刺猬APN是EriCoVs的功能受体，且这种识别不依赖其酶活性。

**2. 溢出风险和宿主嗜性决定因素**
研究人员对93种哺乳动物和鸟类APN直系同源物进行系统评估，发现EriCoVs具有高度受限的APN嗜性，主要识别刺猬APN（包括非洲侏儒刺猬A. albiventris），少量识别猫科（虎、豹、家猫）APN，大鼠APN仅被欧洲毒株FR7137识别。通过构建人APN与刺猬APN的嵌合体并进行精细定位，确定APN结构域2中第288–331位残基（尤其是β16和α2区域）是宿主范围的关键决定因素，其中人APN第319位天冬酰胺的N-连接糖基化会阻碍病毒结合。结论：EriCoVs的受体嗜性受限，少数关键氨基酸残基和糖基化位点决定了其跨种传播屏障。

**3. EriCoV识别刺猬APN的结构基础**
研究人员利用冷冻电镜解析了RU15-1刺突蛋白三聚体（闭合构象）以及RU15-1 RBD与刺猬APN复合物的高分辨率结构（3.55 ?）。结构显示，EriCoV RBD采用一种全新的、侧向位移的APN结合模式，靶向APN结构域2的中心区域，这与α-冠状病毒（TGEV、229E）和δ-冠状病毒（PDCoV）的三种已知结合模式均不同。界面主要由疏水接触（如RU15-1的P523、Y528、Y539等与APN的A283、P286、F415等）和多处氢键介导。关键残基突变实验验证了结构预测。进一步通过mCSM-PPI2计算与突变组合，成功将人APN转化为功能性EriCoV受体（5–6个氨基酸替换）。结论：EriCoVs进化出独特的APN结合策略，结构域2中特定位点及其糖基化状态控制宿主范围。

**4. 蛋白酶促进EriCoV S介导的进入**
研究人员用外源蛋白酶处理EriCoV假病毒，发现胰蛋白酶（包括TPCK处理的胰蛋白酶）能高效切割S蛋白并显著增强病毒进入和细胞–细胞融合；弹性蛋白酶和纤溶酶虽能切割S蛋白，但对进入的促进效果有限或呈抑制效应。在细胞内蛋白酶实验中，共表达TMPRSS2（特别是刺猬TMPRSS2）可增强EriCoV假病毒进入，且具有毒株依赖性；蛋白酶抑制剂实验表明，内体组织蛋白酶（受E64d、CA-074抑制）和细胞表面TMPRSS2（受camostat、MM3122抑制）均可参与激活，而弗林蛋白酶抑制剂无显著影响。使用表达EriCoV S蛋白的rcVSV进行多轮扩增实验，进一步验证了蛋白酶使用的多样性，且融合抑制剂EK1C4可有效抑制扩增。结论：EriCoV的S蛋白激活可由多种蛋白酶以环境依赖和毒株特异的方式介导，其中外源性胰蛋白酶样蛋白酶效率最高。

**5. 针对EriCoV进入的中和抗体**
研究人员用MO1和RU15-1 RBD免疫小鼠，获得54个MO1反应性单抗和67个RU15-1反应性单抗，其中67%（36/54）的MO1靶向抗体和12%（8/67）的RU15-1靶向抗体具有强中和活性。SPR表位分型显示中和活性与特定表位相关。冷冻电镜解析了代表性抗体的复合物结构，阐明BD23-0177通过结合RBM顶端、形成疏水界面并阻碍APN结合来发挥中和作用，该抗体识别的保守表位赋予其广谱中和能力。此外，用刺猬APN mRNA免疫小鼠获得83个APN靶向抗体，其中过半强效中和EriCoV假病毒；这些抗体不识别人类APN，且在非洲侏儒刺猬原代肾脏细胞中可特异性阻断EriCoV假病毒进入，证实内源性APN是感染所必需的。结论：靶向RBD和APN的中和抗体可有效阻断EriCoV进入和扩增，是潜在的应急干预手段。

**讨论总结与研究结论**

讨论部分指出，EriCoVs是刺猬中广泛分布且遗传多样的MERS-CoV近亲，由于刺猬作为城市野生动物或宠物与人类接触频繁，其溢出风险不容忽视。本研究与Jin等（52）的研究共同证实APN是EriCoV的功能受体，将APN受体使用范围扩大到β-冠状病毒，证明了冠状病毒RBD适应受体表面的高度可塑性。三种merbecovirus受体（ACE2、DPP4、APN）均为外肽酶，其在呼吸道和胃肠道上皮的广泛表达可能成为病毒反复利用的优势。尽管NeoCoV与EriCoV在序列和结构上相近，但受体使用的差异提示进化过程中发生了受体切换，仅凭序列相似性预测受体存在局限。受体嗜性分析显示，EriCoV对刺猬APN高度适应，对猫科APN的有限兼容性提示界面微小变化可能降低宿主屏障，因此需持续监测刺猬、猫科及相关物种的病毒序列变化。蛋白酶使用的灵活性与肠道传播途径一致，提示不同宿主和组织环境中可能存在多种入侵路径。

研究结论可翻译为：总体而言，这些发现扩展了merbecoviruses的受体谱系，并为评估可能对家养动物或人类构成威胁的EriCoVs的风险评估和应对措施开发提供了结构和功能框架。