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默贝科病毒（Merbecovirus）与中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）进化关系密切，在欧洲和亚洲的刺猬中广泛流行，引发对其向人类和家养动物发生人畜共患传播的担忧。然而，这些病毒如何进入宿主细胞尚不清楚。本研究测试了来源于欧洲刺猬（*Erinaceu
默贝科病毒（Merbecovirus）与中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）进化关系密切，在欧洲和亚洲的刺猬中广泛流行，引发对其向人类和家养动物发生人畜共患传播的担忧。然而，这些病毒如何进入宿主细胞尚不清楚。本研究测试了来源于欧洲刺猬（*Erinaceus europaeus*）的三种冠状病毒受体，在细胞实验中鉴定出氨肽酶N（aminopeptidase N，APN）是刺猬默贝科病毒的受体。研究人员利用基于复制型水疱性口炎病毒（vesicular stomatitis virus，VSV）的体外报告系统进行假病毒实验以及蛋白结合实验，验证了这一发现。刺猬冠状病毒刺突（spike）蛋白在33°C（接近刺猬生理体温）条件下产生时，与37°C相比表现出增强的感染性。对30种哺乳动物APN直系同源物（orthologue）的筛选表明跨物种受体利用受限，包括无法利用人源APN。冷冻电镜（cryogenic electron microscopy，cryo-EM）揭示了一个独特的糖蛋白–受体结合界面，不同于已知的冠状病毒刺突–APN相互作用，从而阐明了物种屏障机制。这些发现拓宽了研究人员对默贝科病毒及β冠状病毒（Betacoronavirus）受体利用的认识，并为病毒出现的风险评估提供了重要依据。
**论文解读**
**一、研究背景与问题**
默贝科病毒（Merbecovirus）是β冠状病毒（Betacoronavirus）的一个亚属，其原型成员中东呼吸综合征冠状病毒（MERS-CoV）可导致严重的人类呼吸道疾病。自2013年在德国欧洲刺猬（*Erinaceus europaeus*）中首次检出刺猬默贝科病毒（Erinaceus coronavirus，ErinCoV）以来，该病毒已在法国、英国、中国、意大利、波兰、俄罗斯和葡萄牙等多个欧亚国家被陆续报道。刺猬种群的病毒检出率极高——英国约10%，德国和意大利高达约60%——且刺猬在城市环境中密度大、与人类接触频繁，因此它们是否构成人畜共患传染病风险成为备受关注的问题。然而，由于宿主受体未知且病毒分离培养屡屡失败，学界对ErinCoV的病毒学特征几乎一无所知，其向人类溢出的风险仅限于推测。冠状病毒的受体识别是决定其宿主嗜性和物种屏障的关键环节：许多对感染天然不易感的动物，若提供匹配的宿主受体即可被感染。因此，鉴定ErinCoV的入侵受体成为评估其公共卫生风险的首要任务。
**二、研究概述与意义**
在本项发表于《Nature Microbiology》的研究中，研究人员利用自主开发的MerbecoType嵌合刺突筛选平台，首次鉴定出氨肽酶N（APN）是刺猬默贝科病毒的功能性入侵受体——APN此前被认为是α冠状病毒（Alphacoronavirus）的受体，而从未被发现参与β冠状病毒的入侵。研究人员进一步通过假病毒实验、反向入侵实验、30种哺乳动物APN直系同源物跨物种筛选、冷冻电镜结构解析及结构指导的定点突变等方法，全面阐明了ErinCoV利用APN的分子机制及其跨物种传播的受体层面屏障。该发现不仅重新定义了冠状病毒受体利用的范式，也为未来野生动物中新发冠状病毒的风险评估提供了关键实验框架。
**三、关键技术方法**
该研究涉及的主要技术方法包括：（1）基于MERS-CoV骨架的嵌合刺突（chimeric spike）假病毒系统（MerbecoType平台），用于快速筛选功能性受体；（2）复制型水疱性口炎病毒（rcVSV）荧光报告系统，用于评估病毒复制能力；（3）反向假病毒入侵实验——将受体蛋白展示于VSV颗粒表面感染表达刺突的细胞，以更灵敏地检测刺突–受体相互作用；（4）30种哺乳动物APN直系同源物跨物种筛选panel；（5）冷冻电镜（cryo-EM）单颗粒分析，解析分辨率达约2.0 ?；（6）生物膜干涉技术（biolayer interferometry，BLI）测定RBD与APN的结合亲和力（K
D）；（7）结构指导的定点突变与功能验证。细胞系涉及293T、BHK-21、Vero-81和Huh-7.5。
**四、主要研究结果**
**（一）多种ErinCoV假病毒感染表达刺猬APN的细胞**
研究人员构建了涵盖所有已发表ErinCoV受体结合域（RBD）序列变异的嵌合MERS-CoV刺突假病毒panel进行筛选。结果显示，来自意大利（如ErinCoV-12-19）、英国（ErinCoV-UK-2014）和俄罗斯（ErinCoV-MOW-15-1）等多种ErinCoV的嵌合刺突均可介导表达刺猬APN的293T和BHK细胞进入，但不能利用刺猬二肽基肽酶IV（DPP4）或血管紧张素转化酶2（ACE2）。该效应具有严格的物种特异性：人冠状病毒HCoV-229E刺突仅感染表达人APN的细胞，而ErinCoV RBD嵌合刺突仅感染表达刺猬APN的细胞。此外，利用复制型VSV系统验证发现，表达刺猬APN的Vero-81和Huh-7.5细胞可支持ErinCoV-12-19野生型刺突假病毒的完整复制周期。跨膜蛋白酶丝氨酸2（TMPRSS2）的共表达可在293T细胞中显著增强ErinCoV刺突在无外源胰蛋白酶条件下的入侵。
**（二）替代入侵实验揭示ErinCoV广泛利用刺猬APN**
通过交换ErinCoV-12-19和ErinCoV-Ger12的RBD构建嵌合刺突，结合反向假病毒实验（用表达病毒刺突的BHK细胞感染携带刺猬APN的VSV颗粒），研究人员发现了一种灵敏的替代检测手段：即便在传统假病毒实验中完全"无活性"的RBD嵌合体（如ErinCoV-Ger12 RBD），在反向实验中也能介导刺猬APN假病毒的细胞进入，提示宿主细胞的膜蛋白周转机制可能有助于恢复不稳定刺突的功能构象。法国和葡萄牙新报道的ErinCoV毒株RBD同样被证实完全依赖APN入侵，进一步确认了APN作为ErinCoV通用受体的地位。
**（三）假病毒产生中的温度依赖性效应**
刺猬的平均体温（约35°C）显著低于人类（37°C）。研究人员发现，ErinCoV嵌合刺突假病毒在33°C–34°C条件下产生时感染性更强，与人冠状病毒HCoV-229E（适应上呼吸道约34°C环境）的行为一致，而与MERS-CoV和SARS-CoV（适应下呼吸道37°C环境）截然相反。低温产生导致假病毒颗粒中S1/S2裂解形式的刺突蛋白掺入比例增加，表明温度可能通过影响刺突蛋白的折叠效率、热稳定性或蛋白酶加工来调节感染性。
**（四）欧洲和亚洲刺猬ErinCoV刺突与有限APN物种直系同源物相互作用**
对30种不同哺乳动物APN直系同源物的跨物种筛选揭示了一个出乎意料的狭窄受体谱：欧洲刺猬ErinCoV的野生型和嵌合刺突仅能利用刺猬APN以及南非象鼩（*Elephantulus edwardii*）、褐家鼠（*Rattus norvegicus*）和家猫（*Felis catus*）的APN。亚洲刺猬病毒（HKU31-HeB和HKU31-HeN）的野生型刺突同样依赖刺猬APN，但不兼容褐家鼠APN。人类APN在所有测试中均不支持任何ErinCoV进入，提示存在天然的物种屏障。
**（五）ErinCoV RBD与刺猬APN相互作用的结构基础**
研究人员解析了ErinCoV-12-19和ErinCoV-Ger12两种RBD与刺猬APN复合物的冷冻电镜结构，整体分辨率分别达2.03 ?和2.02 ?。两个复合物几乎完全相同，仅在界面存在一个氨基酸差异。RBD通过三个关键区域（zone 1–3）与APN结构域II（domain II）结合，埋藏表面积约575–601 ?2。该结合界面与已知的α冠状病毒（HCoV-229E、TGEV、PRCV、CCoV-HuPn-2018）及猪δ冠状病毒（PDCoV）利用APN的界面完全不同，揭示了冠状病毒在单一受体上趋同进化出不同结合位点的现象。APN Asn-362残基上的N-连接聚糖（N-glycan）的壳二糖核心与RBD Gln-533/Gly-534主链形成堆叠相互作用，参与zone 3界面。BLI测定显示ErinCoV-12-19和ErinCoV-Ger12 RBD与刺猬APN的解离常数（K
D）分别约为19 μM和21 μM，亲和力相似但与已报道的HCoV-229E RBD–人APN相互作用（K
D = 27–434 nM）存在数量级差异。
**（六）RBD和APN突变破坏病毒进入**
结构指导的定点突变实验证实：ErinCoV-12-19 RBD中zone 1的Arg-521突变、zone 2的Tyr-527和Tyr-538突变均完全消除了入侵信号。刺猬APN中zone 1的Phe-415突变为丙氨酸可显著降低病毒进入。人APN中第319位天冬酰胺（Asn-319）的N-糖基化对应于刺猬APN zone 3的Lys-310，推测其空间位阻阻碍了ErinCoV结合，但单独去除该糖基化位点仍不足以赋予人APN受体功能。然而，人APN在zone 2和zone 3的三重组合突变可使其获得支持刺猬冠状病毒RBD高效进入的能力；犬APN和牛APN的单一关键位点突变亦可实现跨物种利用，证实了序列差异是物种屏障的直接分子基础。
**五、讨论与结论**
本研究首次证明，来自欧洲和亚洲刺猬的默贝科病毒可利用宿主物种的APN——以及极少数其他物种的APN——作为入侵受体，且该受体利用界面与所有已知APN依赖性冠状病毒截然不同。值得注意的是，ErinCoV-Ger12野生型及嵌合刺突虽然在标准假病毒实验中无法介导细胞进入，但其RBD与刺猬APN的结合亲和力和复合物结构与ErinCoV-12-19几乎相同，提示在刺突激活、膜融合等下游步骤可能存在尚未被阐明的物种屏障。研究结论认为：目前已发现的ErinCoV由于受体识别层面存在多重障碍——包括温度适应性、APN氨基酸序列及糖基化模式的种间差异、宿主蛋白酶兼容性等——其宿主嗜性极为有限，对人类构成的风险可能较低。然而，默贝科病毒亚属巨大的序列多样性及其重组交换遗传元件的能力仍令人担忧。家猫因在城市环境中与刺猬存在生态交集而面临较高的溢出风险，且猫冠状病毒（FCoV）与犬冠状病毒（CCoV）之间曾发生重组产生可感染人类的α冠状病毒CCoV-HuPn-2018，提示类似的跨物种适应路径在理论上完全可能重现。因此，研究人员呼吁亟需开发更广泛的抗病毒干预策略以预防未来大流行。
