前噬菌体工程大肠杆菌实现肠道沙门氏菌感染的预防性裂解性噬菌体治疗

《Nature Microbiology》：Prophage-encoding engineered bacteria enable prophylactic lytic phage therapy for enteric infection in mice

　　

噬菌体（bacteriophage，phage）治疗是一种前景广阔的抗菌策略，但在针对肠道细菌感染（如鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica Typhimurium，STm））时疗效有限。研究人员假设，在感染前于肠道中建立高浓度靶向病原体的噬菌体，可对后续感染产生预防性保护。为此，研究人员对非负治病大肠杆菌（Escherichia coli）进行工程改造，使其编码一种前噬菌体（prophage），该前噬菌体可产生专性裂解性（obligately lytic）噬菌体后代以靶向STm，同时克服包括限制-修饰（restriction–modification，RM）系统在内的宿主防御机制。研究人员表明，以携带产裂解噬菌体的大肠杆菌溶原菌（lysogen）进行预防性肠道定植，可在感染前产生高水平裂解噬菌体，在STm感染后抑制其定殖，并在STm诱导的小鼠结肠炎模型中改善存活率。利用一株仅限于肠道定殖的STm突变株，研究人员显示产噬菌体大肠杆菌可稳定定殖、持续产生高浓度噬菌体，并从肠道中清除STm。该研究结果提出了一种概念验证：预防性前噬菌体治疗可抵御肠道感染。

论文解读：《Nature Microbiology》发表工程溶原菌预防性噬菌体治疗肠道感染研究

研究背景方面，噬菌体（bacteriophage，phage）治疗作为抗生素替代方案可减少天然肠道菌群扰动、杀伤多重耐药病原体，但在皮肤、呼吸道、血液感染等场景较成功，对肠道病原体如产志贺毒素大肠杆菌、霍乱弧菌、伤寒与鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella enterica Typhimurium，STm）疗效不一。肠道噬菌体治疗存在三大局限：其一，有效杀菌需高噬菌体/细菌比，而病原体常在肠黏膜或组织内定殖致噬菌体难以接触；其二，肠道本底噬菌体与宿主细菌共存，外源噬菌体难根除目标菌，且感染前、同期或感染后给药时机难把握；其三，上消化道可灭活噬菌体，而STm食源性强、对老人儿童及免疫低下人群危害大，且耐药严重、无疫苗，被列为高优先级病原体。因此，研究人员提出在感染前用非致病底盘菌于下消化道持续产靶向裂解噬菌体，以建立保护性噬菌体屏障。

主要关键技术方法方面，研究人员以小鼠为模型，采用链霉素（streptomycin，Str）处理小鼠构建可复现的STm结肠炎与定殖体系；用非致病大肠杆菌K-12及小鼠共生大肠杆菌KP7作细菌底盘；通过P1转导将P22前噬菌体转入大肠杆菌，以组成型启动子表达StyLT1 mod基因克服RM系统，并在染色体外补野生型c2、前噬菌体c2引入终止密码子构建产专性裂解噬菌体P22*的溶原菌（lyto-lysogen）；使用仅限于肠道定殖的STm（invG与ssaV缺失）突变株评估定殖抗性；通过体外共培养、斑点/噬斑 assay、粪便菌群与噬菌体定量、生存曲线与组织学分析开展评价。

研究结果方面，Lysogeny of E. coli with a STm phage：研究人员将P22前噬菌体引入K-12与KP7，证实溶原不改变大肠杆菌生长，且溶原菌可释放游离P22噬菌体，去除抗性标记后KP7产噬菌体升高。

Overcoming STm RM systems：研究人员发现STm的StyLT1与StySA限制-修饰系统使大肠杆菌来源P22效率贴板（efficiency of plating，EOP）降低约4 log；在大肠杆菌中组成型表达StyLT1 mod（DNA甲基酶）后，P22获得与STm匹配甲基化模式，EOP恢复。

Production of lytic P22 phage：研究人员在染色体植入野生型c2（噬菌体阻遏蛋白基因），前噬菌体c2失活，得到专性裂解噬菌体P22；溶原菌生长同普通溶原，P22呈清晰噬斑、不能使STm形成新溶原，但可裂解扩增，对不同沙门氏菌株宿主范围与STm来源P22相当。

Co-culture of E. coli(P22) with STm：体外8小时共培养中，游离P22或单纯大肠杆菌仅小幅压制STm并共存；普通P22溶原菌因溶原化致免疫而不可持续；E. coli(P22*)则近完全根除STm，残留菌落多为噬菌体耐药突变体。

Improved survival against STm：Str处理小鼠先定殖K-12或K-12(P22)，4天后灌胃10²或10⁶ cfu STm；E. coli(P22)组粪便STm/大肠杆菌比更低、粪中持续检出P22、白细胞介素-6与MCP-1等炎症因子下降、生存显著改善；游离噬菌体预防性单次给药会被快速清除且无保护；KP7(P22)在人间感染剂量下改善存活，高剂量下不足。

Lyto-lysogens protect against engraftment by intestinal STm：用仅肠道定殖STm（ΔinvG ΔssaV）重复攻击，E. coli(P22)定殖约10⁷–10⁸ cfu g^?1粪便、粪中P22高载、STm无法定殖；第14天与第28天再次攻毒仍被阻断，肠段分布显示噬菌体与大肠杆菌向结肠递增、STm仅在对照肠中检出；治疗后给游离噬菌体或先给游离噬菌体再给菌均无效，感染后治疗性给予lyto-lysogen仅短暂压制。

讨论部分总结方面，研究人员指出该lyto-lysogen策略把噬菌体工程、活菌递送、定殖抗性合为一体，在感染前于肠腔建立高MOI（multiplicity of infection）环境，优于感染后治疗性与游离噬菌体方案。Str用于模型可重复，但人译需考虑无抗生素、用人共生大肠杆菌底盘、噬菌体宿主范围及病原体腔内/胞内定位；该策略最适于肠腔或黏膜受限病原体。 lambdoid噬菌体（λ样噬菌体）CI–Cro遗传开关知识成熟，可拓展至其他菌-噬组合与其他生境。

研究结论部分翻译：在本研究中，研究人员显示非负病大肠杆菌肠道菌可被工程化以产生专性裂解抗病原体噬菌体，且在口服STm感染前应用该lyto-lysogen可提高小鼠模型存活率并降低病原体肠道定殖。噬菌体治疗传统上用于已确立感染、病原体已扩增至黏膜组织之后；本研究代表一种替代策略，即由前噬菌体携带菌递送、原位产裂解噬菌体（前噬菌体治疗），使感染前建立高浓度游离噬菌体。在该STm感染小鼠模型中，预防性前噬菌体治疗优于感染后治疗，也优于游离噬菌体的预防或治疗应用。各组件曾分别被报道：噬菌体工程治疗、细菌分泌治疗剂、非致病菌抗肠道病原体。本研究将这些策略整合进单一系统。该结果支持高肠噬载量可实现体外高MOI杀菌观察，并借lambdoid噬菌体CI–Cro开关与阻遏蛋白失活知识构建lyto-lysogen。鉴于Enterobacteriaceae中lambdoid噬菌体普遍，类似系统可防护肠道及其他位点的病原体。临床前鼠模用Str处理，人译需评估无抗生素、人源底盘、噬菌体广度与病原定位；该lyto-lysogen是可行的预防性方案，推进了噬菌体治疗的传统范式。