《Journal of Extracellular Vesicles》：Neural Stem Cell-Derived Extracellular Vesicles Improve CNS Delivery and Therapeutic Efficacy of Antisense Oligonucleotide in Amyotrophic Lateral Sclerosis
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反义寡核苷酸（ASOs）在治疗肌萎缩侧索硬化症（ALS）等神经退行性疾病方面具有临床前景。然而，其疗效受到需要侵入性给药、中枢神经系统（CNS）穿透性差、细胞摄取效率低以及清除迅速等因素的制约。在本研究中，研究人员开发了神经干细胞来源的细胞外囊泡（NSC-EV
反义寡核苷酸（ASOs）在治疗肌萎缩侧索硬化症（ALS）等神经退行性疾病方面具有临床前景。然而，其疗效受到需要侵入性给药、中枢神经系统（CNS）穿透性差、细胞摄取效率低以及清除迅速等因素的制约。在本研究中，研究人员开发了神经干细胞来源的细胞外囊泡（NSC-EVs）作为天然载体，以增强基于ASO的ALS治疗的中枢神经系统靶向性和治疗效果。通过被动装载方法，治疗性ASOs被高效地结合到NSC-EVs上（NSC-EV-ASO）。与游离ASOs相比，NSC-EV-ASOs在体外表现出显著增强的神经元摄取，在体内经脑室内（intracerebroventricular）、鼻内（intranasal）或静脉内（intravenous）给药后，表现出增加的中枢神经系统蓄积和神经元定位。在功能上，NSC-EV-ASOs在ALS细胞模型中降低了突变型SOD1（超氧化物歧化酶1）蛋白表达以及C9orf72（第9号染色体开放阅读框72）基因座中的致病性六核苷酸重复序列。在ALS小鼠模型中，与游离ASOs相比，鼻内给予NSC-EV-ASOs在研究期间更有效地延缓了疾病发作、改善了运动功能、保护了运动神经元并减轻了星形胶质细胞活化。这些发现提供了概念验证证据，支持NSC-EV作为一个有前景的平台，不仅增强了ASOs的中枢神经系统递送，还有助于整体治疗活性，为推进ALS乃至其他神经系统疾病的核酸治疗提供了一种协同策略。
## 论文解读：神经干细胞来源的细胞外囊泡作为反义寡核苷酸递送平台治疗肌萎缩侧索硬化症
### 一、研究背景与科学问题
肌萎缩侧索硬化症（Amyotrophic Lateral Sclerosis, ALS）是一种致死性神经退行性疾病，其特征是上、下运动神经元进行性退化，导致瘫痪和死亡，患者通常在症状出现后3–5年内死亡。尽管对ALS致病机制的理解不断深入，但有效治疗方法仍然有限。约10%的ALS病例为家族性，主要由超氧化物歧化酶1（Superoxide Dismutase 1, SOD1）基因突变和第9号染色体开放阅读框72（Chromosome 9 Open Reading Frame 72, C9orf72）基因座中的六核苷酸重复扩增（Hexanucleotide Repeat Expansions, HREs）引起。这些突变通过多种机制驱动疾病进展，包括正常蛋白功能丧失和毒性功能获得效应，如蛋白错误折叠、RNA聚集点（RNA foci）积累及二肽重复蛋白聚集。
反义寡核苷酸（Antisense Oligonucleotides, ASOs）作为一种可直接靶向上述致病转录本的治疗策略而备受关注。ASOs通过与互补RNA序列结合，可经由降解mRNA、改变剪接或抑制翻译来调控基因表达。近期，靶向降低突变SOD1表达的ASO药物Tofersen获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，凸显了这一方法的临床潜力。同样，靶向含C9orf72 HRE的RNA的ASOs已进入临床试验阶段。然而，ASO治疗ALS及其他神经系统疾病面临显著的递送挑战：在中枢神经系统（Central Nervous System, CNS）中达到有效浓度通常需要进行侵入性鞘内或脑室内给药，存在感染、不适和患者依从性降低等风险；全身给药虽然侵入性较小，但受到血脑屏障（Blood–Brain Barrier, BBB）穿透性差、CNS滞留有限和外周非靶向分布等问题的困扰；此外，ASOs较大的分子尺寸和负电荷阻碍了有效的被动细胞摄取，且易被循环中的核酸酶降解。
细胞外囊泡（Extracellular Vesicles, EVs）是几乎所有细胞类型释放的纳米级膜性颗粒，近年来作为核酸治疗的天然载体受到关注。EVs的内源性来源赋予了其相较于合成纳米颗粒的高生物相容性、低免疫原性和较低的全身清除率。EVs的组织趋向性取决于其亲代细胞来源。例如，来自中枢神经系统的EVs可以穿过BBB并选择性地与神经元群体相互作用。神经干细胞来源的细胞外囊泡（Neural Stem Cell-Derived Extracellular Vesicles, NSC-EVs）对于CNS靶向治疗尤其具有吸引力，已有研究表明NSC-EVs在创伤性脑损伤、阿尔茨海默病和卒中模型中发挥神经保护和抗炎作用。然而，NSC-EVs能否被用作载体递送ASOs等核酸治疗药物治疗ALS及其他神经系统疾病，仍是一个悬而未决的问题。本研究旨在探究人NSC-EVs是否能够作为一种平台，有效递送治疗性ASOs用于ALS治疗，包括评估其体外神经元摄取、体内生物分布和稳定性，以及在ALS细胞和小鼠模型中的治疗效果。
### 二、主要技术方法概述
研究人员从神经干细胞条件培养基中通过差速超速离心法（Differential Ultracentrifugation）分离EVs，并采用纳米颗粒追踪分析（Nanoparticle Tracking Analysis, NTA）、透射电子显微镜（Transmission Electron Microscopy, TEM）、纳米流式细胞术（Nano Flow Cytometry, NFC）和蛋白质免疫印迹（Western Blotting）对EVs进行表征。治疗性ASOs采用硫代磷酸酯（phosphorothioate）骨架修饰和2′-O-甲氧基乙基（2′-O-Methoxyethyl, 2′-MOE）化学修饰合成，并在3′端偶联Atto-647N荧光染料。ASOs通过被动共孵育法装载至NSC-EVs中，以SplintR连接定量PCR（SplintR-qPCR）评估ASO完整性及核酸酶保护效果。体外细胞摄取实验采用成像流式细胞术（Imaging Flow Cytometry），使用人神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y、体外BBB模型hCMEC/D3神经血管细胞和人成纤维细胞BJ。溶酶体运输分析采用LysoTracker染色结合共聚焦显微镜。体内生物分布研究使用野生型C57BL/6J小鼠，给药途径包括脑室内注射、鼻内给药和静脉注射，通过IVIS活体成像系统进行离体器官荧光成像评估。ALS细胞模型包括过表达GFP标记突变SOD1
G93A的NSC-34细胞系和携带C9-HRE突变的ALS患者来源成纤维细胞。体内疗效研究使用SOD1
G93A转基因ALS小鼠模型（B6SJL-TgN[SOD1*G93A]1Gur/J），从出生后第60天开始进行鼻内给药，通过握力测试、转棒实验（Rotarod）和神经功能缺损评分（Neurological Deficit Score, NDS）等行为学评估，以及脊髓免疫染色和Western Blot进行组织学与分子分析。
### 三、主要研究结果
**3.1 治疗性ASOs装载至NSC-EVs**
研究人员从神经干细胞条件培养基中分离EVs，NTA显示颗粒直径约130 nm（主峰约135.1 nm），TEM证实其具有典型的双层脂质膜形态。MemGlow-488膜染色显示约92%的颗粒保持完整脂质双层。Western Blot检测到典型EV标志物ALG-2相互作用蛋白X（Alix）、Flotillin-1、Syndecan结合蛋白（Syntenin-1）和CD9（分化簇9）的富集，且未检测到内质网伴侣蛋白Calnexin。通过被动共孵育法将荧光标记ASOs装载至NSC-EVs，评估了不同ASO与EV摩尔比（10k、25k、50k和100k分子/EV）的装载效果。虽然每个EV的绝对ASO含量随比例升高而增加，但装载效率在10k ASO/EV时达到峰值约25%，并随比例升高而下降。共孵育时间变化对装载效率影响较小。最终选择25k ASO/EV和90分钟孵育作为优化条件。装载后，NSC-EV-ASOs保持单峰粒径分布（峰值约95 nm），Western Blot显示EV标志物表达未发生改变。核酸酶保护实验结合SplintR-qPCR分析表明，经DNase处理后，EV相关ASO信号仍有74.2% ± 1.8%可检出，而游离ASO完全降解，证实EV膜对ASO具有保护作用。
**3.2 NSC-EVs增强治疗性ASOs的细胞摄取**
将NSC-EV-ASOs或等量游离ASOs与SH-SY5Y人神经母细胞瘤细胞共孵育4小时后，采用成像流式细胞术进行定量分析。结果表明，NSC-EV介导的递送显著增加了荧光标记ASOs的细胞摄取，表现为每个细胞的最大像素强度显著升高。在不同细胞类型中的摄取评估显示，NSC-EV-ASOs在神经元（SH-SY5Y）和神经血管细胞（hCMEC/D3）中的摄取显著高于非神经元成纤维细胞（BJ），定量分析显示神经元和神经血管细胞的最大像素强度分别约为成纤维细胞的1.5倍和2倍，证实了NSC-EVs优先向CNS相关细胞类型递送货物的能力。溶酶体运输分析表明，处理70分钟后，NSC-EV-ASO荧光信号中有73.2% ± 13.2%与LysoTracker阳性溶酶体区室共定位，而在处理90分钟后该比例降至38.4% ± 10.5%，提示部分EV递送的ASOs可能随时间从内溶酶体区室中释放。
**3.3 NSC-EV介导的递送改善ASOs的体内CNS靶向性**
经脑室内注射后，在第7天（PD7），NSC-EV-ASO组和游离ASO组的ASO相关荧光信号主要保留在脑内，外周器官信号极少。值得注意的是，到第21天（PD21）时，NSC-EV-ASO组的荧光信号在脑内仍可检测到，而游离ASO组的信号已基本不可见，表明NSC-EVs能保护ASOs免受快速清除并延长其在CNS中的滞留。经鼻内给药后120分钟，NSC-EV-ASOs表现出强烈的脑内蓄积，而游离ASOs几乎未显示CNS摄取。经静脉给药后，NSC-EV-ASO组的脑内荧光信号显著强于游离ASO组，同时保持全身分布特征。使用HEK 293T细胞来源的EVs（293T-EVs）作为非神经来源EV对照，发现NSC-EV-ASO处理小鼠的脑相关荧光信号高于293T-EV-ASO处理组，提示EV细胞来源可能影响脑生物分布。脑切片的免疫荧光染色显示，荧光ASO信号主要与神经元核抗原（NeuN）阳性神经元共定位，证实NSC-EVs在体内可将ASOs有效递送至神经元群体。
**3.4 NSC-EV-ASOs抑制ALS细胞模型中的致病遗传因素**
在过表达多西环素诱导的GFP标记突变SOD1
G93A的NSC-34细胞（小鼠运动神经元样细胞系）中，Western Blot分析显示，NSC-EV-ASO处理48小时后SOD1蛋白水平的降幅比等剂量游离ASO处理更为显著。荧光成像进一步验证了SOD1-GFP荧光强度的明显降低，且敲低程度与单细胞水平的ASO蓄积量相关，呈剂量依赖性。为评估NSC-EVs自身的内在生物活性是否对观察到的细胞效应有贡献，研究人员制备了脂质体作为对照，并在匹配的颗粒数和ASO浓度条件下进行比较。结果显示，单独的NSC-EV处理相对于脂质体对照产生了适度但可测量的效果，而NSC-EV-ASO处理产生的效果显著强于EV单独处理或脂质体-ASO处理，提示增强的活性源于EV载体与ASO货物的协同作用。在携带C9-HRE突变的ALS患者来源成纤维细胞中，RT-qPCR显示NSC-EV-ASO-C9处理对C9-HRE转录本的降低效果比等剂量游离ASO更为显著，而正常的C9orf72表达不受影响。RNA荧光原位杂交（FISH）证实NSC-EV-ASO-C9显著减少了致病性核内RNA聚集点的数量，而等剂量游离ASO效果明显较差。
**3.5 NSC-EV-ASOs延缓ALS小鼠模型疾病发作并改善运动缺陷**
在SOD1
G93A ALS小鼠模型中，从出生后第60天至第85天进行每两周一次的鼻内给药，并在第100天和第105天追加加强剂量（总剂量约28 μg ASO/只），监测至第110天处死进行分析。NSC-EV-ASO处理显著延缓了疾病发作，将对照组平均发病时间从约P85推迟至NSC-EV-ASO组约P95。握力测试显示NSC-EV-ASO处理组（59.27 ± 2.81 N/g）显著优于载体对照组（39.38 ± 3.23 N/g）和游离ASO组（54.75 ± 4.00 N/g）。转棒实验显示NSC-EV-ASO处理组保持了更好的运动协调能力。肌肉质量分析表明，胫骨前肌重量在各组间无显著差异，但NSC-EV-ASO处理组腓肠肌重量（0.48% ± 0.01%）显著高于载体对照组（0.40% ± 0.01%）和游离ASO组（0.39% ± 0.04%），提示肌肉完整性得到部分保留。在第110天脑组织中进行的SplintR-qPCR检测显示，NSC-EV-ASO处理组完整ASO分子的相对丰度显著高于游离ASO组（倍数变化：1.39 ± 0.16）。
**3.6 NSC-EV-ASOs降低ALS小鼠SOD1表达、保护运动神经元并减轻神经炎症**
脊髓组织的Western Blot分析显示，NSC-EV-ASO处理组小鼠SOD1蛋白水平较对照组显著降低。脊髓切片免疫染色显示，载体组和游离ASO组出现广泛的运动神经元丢失，而NSC-EV-ASO处理组表现出显著的运动神经元保护，定量分析显示NSC-EV-ASO组运动神经元计数（9.67 ± 0.80）显著高于游离ASO组（7.60 ± 1.44）和载体组（5.50 ± 0.29）。胶质纤维酸性蛋白（Glial Fibrillary Acidic Protein, GFAP）免疫荧光染色评估星形胶质细胞活化程度，结果显示载体组ALS小鼠表现出强烈的星形胶质细胞活化，游离ASO组有中度减轻，而NSC-EV-ASO处理组显著抑制了星形胶质细胞活化，定量分析证实NSC-EV-ASO组星形胶质细胞密度（76.17 ± 24.16）显著低于游离ASO组（242.00 ± 30.75）和载体组（371.50 ± 83.67）。
### 四、讨论与结论
本研究证明了NSC-EVs可被开发为一种高效、生物相容性良好且非侵入性的ASO递送平台，能够增强ASOs在ALS治疗中的CNS靶向性和治疗效果。与游离ASOs相比，NSC-EV相关ASOs表现出更好的稳定性、优先的神经细胞靶向性、增强的CNS蓄积和改善的功能活性。这些优势可能源于NSC-EV膜的天然组成，保留了生物相容性并利用了内源性运输机制进行细胞通讯和BBB转运。NSCs分泌的EVs富含神经细胞粘附分子1（NCAM1）、L1细胞粘附分子（L1CAM）和整合素等粘附和导向分子，这些表面成分可能促进受体介导的内吞或与神经细胞的膜融合，从而促进EVs的摄取及其跨BBB转位。此外，NSC-EVs富含脂筏的膜可能保护ASOs免受细胞外核酸酶降解并减少快速肾脏清除。多种给药途径的评估进一步突显了该平台的转化多样性：鼻内给药实现了无需手术干预的脑实质分布，可能通过嗅神经和三叉神经通路直接转运绕过BBB；静脉给药则产生广泛的CNS和外周分布。
在治疗层面，观察到的疗效可能源于ASO货物与NSC-EVs内在生物活性的协同作用——NSC-EVs内源性货物（包括具有神经保护作用的miRNA和蛋白质）可能补充ASO介导的基因调控。在降低的累积剂量条件下（约28 μg ASO/只，远低于既往研究常用的约350 μg），研究人员观察到约10天的疾病发作延迟以及运动功能和握力的改善。在作用机制上，NSC-EV-ASOs有效降低了致病性SOD1表达，保护了脊髓运动神经元，并减轻了神经炎症。
研究人员也指出了一些局限性：EV-ASO装载的分子机制、细胞摄取和内体逃逸过程尚不完全清楚；生物分布分析主要依赖荧光标记，无法区分完整ASO和降解片段；ASO的表面结合与腔内包裹对细胞内递送行为的不同贡献有待阐明；不同骨骼肌群对治疗反应的差异需要进一步研究；将本平台推向临床仍需进行优化给药方案、长期安全性、免疫原性评估以及NSC-EV生产的标准化。
**研究结论**：本研究确立了NSC-EVs作为一种天然、可扩展且临床可适应的平台，用于向CNS进行靶向核酸递送。通过改善ASO的稳定性、分布和疗效，NSC-EVs有助于克服核酸类干预手段在遗传性和退行性脑疾病中面临的主要障碍。这些发现拓展了EVs的治疗应用价值，并突显了利用再生细胞来源的纳米囊泡作为下一代递送系统的潜力，以在人类CNS中实现精准高效的基因治疗。
