海马长投射GABA能神经元靶向抑制下乳头体区海马投射细胞

《The Journal of Physiology》：Hippocampal long-range GABAergic neurons target hippocampal-projecting cells of the supramammillary area

　　

摘要专业翻译 下乳头体区（supramammillary area, SuM）以其与海马的直接连接及其对海马的多重影响而著称。相比之下，关于反向连接——即海马对SuM的影响——所知甚少。研究人员发现，海马向SuM提供直接的GABA能输入，这些输入源自背侧和腹侧海马的多个海马亚区。尽管海马中表达一氧化氮合酶的长投射抑制性NOS+细胞（long-range inhibitory NOS+ cells, LINCs）以及表达生长抑素的亚群均参与海马-SuM通讯，但投射至SuM的海马细胞不表达其他海马抑制性投射神经元亚群常见的标志物，包括毒蕈碱型胆碱能受体2（muscarinic cholinergic receptor 2, M2R）或血管活性肠肽（vasoactive intestinal protein, VIP）。病毒示踪和光遗传学实验表明，海马抑制性细胞密集支配外侧SuM，并优先支配那些投射回海马的SuM神经元。值得注意的是，这并非简单的反馈抑制，因为亚环路之间存在交叉对话——背侧海马细胞不仅抑制投射至背侧海马的SuM细胞，也抑制投射至腹侧海马的SuM细胞，腹侧海马细胞亦如此。综上所述，该研究确立了海马-SuM环路是双向的，并由此揭示了海马长投射GABA能神经元在区域间通讯中的又一作用。

论文解读

一、研究背景与科学问题

下乳头体区（supramammillary area, SuM）是下丘脑中的一个区域，通过直接投射至海马，在记忆和振荡活动中发挥重要调控作用。既往研究已充分阐明SuM对海马的影响，包括空间记忆、社交记忆以及海马theta振荡的调控。例如，表达P物质的Tac1⁺ SuM细胞可投射至海马齿状回（dentate gyrus, DG）和CA2区，编码运动速度并驱动运动行为；而Tac1^?细胞则与海马theta振荡的相位锁定和峰电位时序控制相关。此外，投射至背侧海马的SuM细胞影响空间记忆，投射至腹侧海马的SuM细胞则影响情感行为。

然而，与SuM对海马的广泛研究相比，海马对SuM的反向影响长期未受重视。传统观点认为海马本体缺乏向SuM的投射，尽管下托（subiculum）等区域存在向SuM的兴奋性投射，但海马本部（hippocampus proper）是否直接投射至SuM一直存在争议。一项早期示踪研究曾提示海马中存在非锥体神经元向SuM投射，但后续研究未能确认CA2锥体神经元向SuM的投射。因此，海马是否通过抑制性神经元直接调控SuM，以及这种调控的环路组织方式，是亟待解决的科学问题。

二、研究内容与主要结论

研究人员通过多种病毒示踪、免疫组化、光遗传学结合离体脑片电生理记录等手段，系统揭示了海马至SuM的抑制性投射环路。研究发现，海马向SuM提供直接的GABA能输入，这些输入源自海马多个亚区（齿状回门区、CA3、CA2、CA1）并分布于海马背腹轴全程。投射至SuM的海马细胞主要包括表达一氧化氮合酶的长投射抑制性NOS⁺细胞（LINCs）和表达生长抑素（somatostatin, SST）的细胞亚群，但不表达M2R、VIP或小清蛋白（parvalbumin, PV）等常见标志物。海马抑制性纤维密集支配外侧SuM，且优先支配投射回海马的SuM神经元。值得注意的是，这种连接并非简单的同域反馈抑制——背侧海马细胞既可抑制投射至背侧海马的SuM细胞，也可抑制投射至腹侧海马的SuM细胞，腹侧海马细胞亦呈现同样的交叉对话模式。该研究确立了海马-SuM环路是双向连接的，并揭示了海马长投射GABA能神经元在区域间通讯中的新作用。

三、关键技术方法

研究人员主要运用了以下关键技术手段：荧光金（Fluorogold, FG）逆行示踪结合免疫组化，用于鉴定投射至SuM的海马细胞分布及分子标志物表达；Cre-loxP系统介导的AAV病毒策略，在NOS-Cre和SST-Cre小鼠中表达突触素标签的EGFP（SypEGFP），用于定量分析不同海马亚区和不同细胞类型对SuM的支配密度；AAV-mDlx-GFP用于顺行标记海马抑制性纤维在SuM的分布；光遗传学结合离体脑片全细胞膜片钳记录，用于验证海马抑制性纤维与SuM神经元的功能性突触连接；逆行AAV（AAVrg）标记投射至背侧或腹侧海马以及内侧隔区的SuM神经元，用于分析投射特异性的环路连接模式。实验使用成年小鼠，雌雄均有纳入。

四、研究结果

海马多个亚区的抑制性神经元投射至SuM

通过向SuM注射小体积（10 nL）FG逆行示踪剂，研究人员在CA1、CA2、CA3和DG门区均鉴定到FG⁺细胞，且主要分布于始层（stratum oriens），沿海马前后轴分布，后部切片中数量更多。免疫组化分析显示，各海马亚区中相当比例的FG⁺细胞呈SST免疫阳性（CA1: 32.4%，CA2: 47.3%，CA3: 31.4%，DG: 57.1%），而几乎不表达M2R、PV或VIP。AAV-mDlx-GFP全海马注射后观察到海马抑制性纤维密集支配同侧SuM，对侧SuM支配较稀疏，内侧SuM支配极少。

背侧和腹侧海马的SST⁺和NOS⁺细胞投射至SuM

在SST-Cre和NOS-Cre小鼠中分别于背侧或腹侧海马注射Cre依赖的SypEGFP病毒，定量分析SuM各区域的突触前末梢密度。结果显示，海马SST⁺细胞对SuM的支配显著多于NOS⁺细胞，其中腹侧海马SST⁺细胞对SuM的支配最为密集。前部与后部SuM接受的海马输入无显著差异，但内侧SuM接受的海马支配显著少于同侧和对侧SuM。背侧海马SST⁺和NOS⁺细胞对同侧与对侧SuM的支配程度相似，而腹侧海马SST⁺细胞则显著偏好同侧SuM。此外，通过NOS-Cre小鼠中表达核定位mScarlet并结合SST免疫组化和FG逆行示踪，研究人员确认投射至SuM的海马细胞至少包含三种神经化学亚群：仅SST阳性、仅NOS阳性、以及SST和NOS双阳性细胞。

海马抑制性神经元靶向神经化学多样的SuM细胞

在Tac1-Cre×tdTomato小鼠中于全海马表达ChR2，对SuM中Tac1⁺和Tac1^?细胞进行全细胞膜片钳记录。光刺激海马抑制性纤维后，Tac1⁺和Tac1^?细胞均记录到光诱发的抑制性突触后电流（IPSC），且两类细胞接受海马输入的比例（分别为18.2%和18.8%）和IPSC幅度无显著差异，均表现为配对脉冲抑制。在PV-Cre小鼠中，SuM中确实存在稀疏的PV⁺细胞，且多数为快速放电细胞（最大放电频率200±25 Hz），其中23.1%的PV⁺细胞接受直接的海马抑制性输入。这表明海马抑制性输入靶向神经化学身份多样的SuM细胞。

海马抑制性神经元优先靶向投射回海马的SuM神经元

通过向背侧或腹侧海马注射逆行AAV（AAVrg-hSyn-mCherry）标记SuM→dHi或SuM→vHi神经元，同时在背侧或腹侧海马表达mDlx-ChR2，对标记的SuM神经元进行膜片钳记录。结果显示，背侧和腹侧海马均可直接抑制SuM→dHi和SuM→vHi细胞，且各组合间的连接率无显著差异，表明海马-SuM环路存在跨背腹轴的交叉对话。将所有病毒方案合并分析，SuM→Hi细胞接受海马抑制性输入的比例（18.3%）显著高于非荧光标记细胞（8.0%），表明海马抑制性输入优先靶向投射回海马的SuM神经元。

光诱发内向和外向突触后电流具有相似特性

在记录中，除预期的内向GABA_A介导电流外，偶尔观察到外向光诱发电流。外向电流的起始潜伏期（4.9±0.4 ms）与内向电流（4.3±0.3 ms）无显著差异，且两者均可被GABA_A受体拮抗剂gabazine完全阻断，表明均为GABA_A介导的抑制性反应。外向电流可能源于局部氯离子浓度的差异，但无论机制如何，所有反应均一致表明海马对SuM提供抑制而非兴奋性输入。

海马抑制性神经元优先靶向SuM的爆发-波放电神经元

在记录的290个SuM细胞中，7.6%的细胞表现出独特的近阈值爆发-波（burst-wave）放电模式，其特征为短峰间期（首个峰间期9.98±1.30 ms）后跟随慢波后超极化。此类细胞不限于任何已检测的神经化学标志物（Tac1、PV、NOS），但在SuM→vHi细胞中比例较高（14.3%），而SuM→dHi细胞中为5.5%，SuM→MS细胞中为0%。爆发-波细胞接受海马抑制性输入的比例（29.4%）显著高于非爆发-波细胞（10.2%），而回弹放电（rebound spiking）细胞与无非回弹放电细胞接受海马输入的比例无显著差异。这表明爆发-波放电模式是预测海马抑制性支配的一个独特指标。

五、讨论与结论

该研究揭示了海马-SuM环路是双向连接的。海马通过SST⁺和NOS⁺ GABA能神经元向SuM提供直接的抑制性输入，这些输入源自海马多个亚区并沿背腹轴分布。海马输入对SuM前部和后部的支配程度相当，但对内侧SuM支配稀疏，而密集支配外侧SuM——正是SuM→Hi神经元富集的区域。海马抑制性细胞优先靶向投射回海马的SuM神经元，而非优先靶向局部抑制性细胞，这与长投射抑制性细胞常介导去抑制作用的经典模式不同。海马-SuM抑制性连接跨越背腹轴形成交叉对话，即背侧海马可抑制投射至腹侧海马的SuM细胞，反之亦然，这为海马调控SuM对海马的输入提供了直接途径。此外，海马抑制性输入优先靶向爆发-波放电的SuM细胞，鉴于既往体内研究显示SuM爆发放电神经元在海马尖波涟漪期间活跃，该连接可能在记忆巩固相关的海马-SuM协同活动中发挥重要作用。该研究拓展了对海马长投射GABA能神经元功能的认识，并确立了一个此前未被研究的海马-SuM相互作用的新连接。