《Microbial Biotechnology》：Endogenous CRISPR-Based Removal of Tetracycline Resistance in Bifidobacterium animalis subsp. lactis Through a Safe-by-Design Approach
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## 专业术语摘要翻译（中文）
动物双歧杆菌乳亚种（*Bifidobacterium animalis* subsp. *lactis*）被广泛用作益生菌；然而，四环素抗性基因tetW的存在因其在肠道菌群中的潜在可移动性而引发安全性和监管方面的担忧。在本研究中
## 专业术语摘要翻译（中文）
动物双歧杆菌乳亚种（*Bifidobacterium animalis* subsp. *lactis*）被广泛用作益生菌；然而，四环素抗性基因tetW的存在因其在肠道菌群中的潜在可移动性而引发安全性和监管方面的担忧。在本研究中，研究人员采用安全设计（Safe-by-Design）策略，利用动物双歧杆菌乳亚种BLC01的内源性CRISPR-Cas系统，通过引入提前终止密码子使tetW基因失活。全基因组测序确认了预期编辑并排除了相关的脱靶效应。tetW失活显著降低了四环素最低抑菌浓度（minimum inhibitory concentration，MIC），使菌株恢复至低于双歧杆菌四环素临界值（cut-off value，8 μg/mL）的敏感性。比较表型分析表明，编辑后菌株（BLC01-2F3G10）保留了关键的益生特性，包括耐酸、耐胆汁、耐渗透压胁迫、胞外多糖（exopolysaccharide，EPS）产生、聚集能力、模拟胃肠道消化存活率以及肠上皮细胞黏附能力。重要的是，在长期暴露于亚抑制性最低选择性抗菌浓度后未观察到四环素抗性回复突变，表明编辑后表型具有遗传稳定性。综上，这些发现表明，基于内源性CRISPR的基因组编辑可被用于选择性去除益生菌菌株中的抗菌药物耐药性决定因子，同时保留其功能，支持开发具有更高安全性且降低抗菌药物耐药性在人体肠道中传播潜力的下一代益生菌。
## 论文解读文章
### 一、研究背景与问题
双歧杆菌属（*Bifidobacterium*）是研究最广泛、应用最多的益生菌类群之一，在调节肠道微生物群落、增强肠屏障完整性及调节宿主免疫应答等方面发挥重要作用。其中，动物双歧杆菌乳亚种（*Bifidobacterium animalis* subsp. *lactis*）是食品和膳食补充剂中最常用的益生菌。然而，系统发育基因组学和计算机分析揭示，四环素抗性基因tetW在该亚种菌株中广泛分布。tetW编码一种核糖体保护蛋白，可阻止四环素与核糖体结合。更值得关注的是，该基因常与可移动遗传元件相邻，存在水平基因转移的潜在风险。比较序列分析显示，tetW基因座在双歧杆菌与人源共生菌和致病菌之间存在98%–100%的高度核苷酸一致性，且其GC含量（51.9%）显著低于BLC01基因组整体GC含量（60.5%），提示该基因可能通过基因转移事件水平获得。根据欧洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）指南，任何抗菌药物抗性基因（antimicrobial resistance gene，ARG）均被视为危害因素，除非能证明其固有属性，否则可能使菌株丧失合格安全推定（Qualified Presumption of Safety，QPS）地位。近年来对商业益生菌产品的宏基因组分析已检测到超过70种不同的ARGs，其中四环素抗性基因杂合体tet(W/N/W)常与整合性接合元件相关联。鉴于益生菌菌株中可移动ARGs带来的潜在公共卫生问题，需要靶向策略来消除或减轻这些元件。
基因组编辑（genome editing，GE）已被提出作为细菌菌株遗传改良的一种有前景的方法。CRISPR-Cas系统被归类为新技术基因组技术（New Genomic Techniques，NGTs），EFSA指出与应用既定基因组技术或传统诱变相比，NGTs应用于微生物本身不会对人类、动物或环境引入新的危害。安全设计（Safe-by-Design，SbD）概念被引入以鼓励从开发最早期阶段就整合安全性考量。本研究旨在评估经内源性CRISPR-Cas系统编辑tetW基因的动物双歧杆菌乳亚种BLC01的安全性以及与益生菌活性相关的生理特性。
### 二、研究内容与结论
研究人员成功利用动物双歧杆菌乳亚种BLC01内源性的Type I-U CRISPR-Cas系统，通过引入三个连续提前终止密码子使tetW基因失活，获得了tetW阴性突变株BLC01-2F3G10。全基因组测序确认了预期编辑并排除了相关脱靶效应。tetW失活使四环素MIC从32 μg/mL急剧降至1 μg/mL，低于EFSA规定的双歧杆菌四环素临界值8 μg/mL，证实了该基因在四环素抗性表型中的关键作用。比较表型分析表明，编辑后菌株保留了关键益生特性。重要的是，在长期暴露于亚抑制性最低选择性抗菌浓度后未观察到四环素抗性回复突变，表明编辑后表型具有遗传稳定性。该工作为SbD策略提供了概念验证，展示了利用内源性CRISPR系统选择性去除益生菌菌株中ARGs同时保持功能性的可行性。
### 三、主要关键技术方法
本研究涉及以下关键技术方法：（1）利用CRISPRCasFinder和CRISPRTarget对BLC01内源性CRISPR-Cas系统进行生物信息学鉴定和间隔序列分析，确定protospacer-adjacent motif（PAM）序列；（2）构建含人工crRNA和同源定向修复模板（repair template，RT）的编辑质粒pAM1-tetW rep，转化BLC01感受态细胞；（3）通过电转化方法将编辑质粒导入BLC01并进行质粒消除；（4）利用Illumina MiSeq和Oxford Nanopore Technologies（ONT）平台进行全基因组测序，通过Flye和Pilon进行组装和抛光，使用Bakta进行功能注释，利用CLC Genomic Workbench进行变异检测；（5）依据ISO 10932:2010标准通过微量肉汤稀释法测定抗菌药物敏感性；（6）通过INFOGEST静态消化方案进行体外模拟胃肠道消化实验；（7）利用人结肠腺癌细胞系Caco-2和HT-29进行黏附实验。菌株来源：BLC01来自Sacco System（意大利Cadorago）。
### 四、研究结果
#### 3.1 tetW突变株的获得
生物信息学分析鉴定出BLC01含有Type I-U CRISPR-Cas系统，包含19个间隔序列和保守的36-nt直接重复序列。间隔序列分析揭示了保守的5′-CAC-3′ PAM序列。研究人员设计33-nt间隔序列靶向tetW基因5′区域，构建含人工CRISPR阵列和RT的编辑质粒。RT引入七个核苷酸替换，在TetW蛋白第62–64位产生三个连续提前终止密码子。经96个克隆筛选，获得两个四环素敏感（TetS）表型克隆（2F3和2EH3）。2F3克隆经质粒消除后命名为BLC01-2F3G10。全基因组测序与野生型比较确认了tetW中预期突变的存在。此外，鉴定到两个非预期突变：一个非编码DNA区域的胞嘧啶缺失，以及磷脂酰甘油-前脂蛋白二酰甘油转移酶（Lgt）蛋白中的一个氨基酸替换（苏氨酸→脯氨酸）。三维结构分析表明该突变位于α-螺旋边界，蛋白质整体构象未发生改变，提示该突变不太可能影响蛋白质功能。
#### 3.2 抗菌药物抗性谱及对四环素的生长响应
对八种抗菌药物的MIC测定结果显示，野生型BLC01的四环素MIC高达32 μg/mL，超过EFSA微生物临界值8 μg/mL。tetW失活后，四环素MIC急剧降至1 μg/mL，远低于EFSA阈值。其余抗菌药物仅在两个菌株间观察到微小差异，且所有值均处于或低于EFSA临界阈值，表明tetW缺失特异性地影响四环素敏感性而不改变对其他类别抗菌药物的敏感性。生长动力学实验显示，在无抗菌药物条件下，两菌株生长动力学相似；在亚致死浓度（0.5 μg/mL）下，突变株指数生长期起始明显延迟且最终OD更低；在致死浓度（1 μg/mL）下，突变株在整个24 h期间未能生长至OD620约0.1以上，而野生型仍保持部分生长。
#### 3.3 野生型和突变株的益生特性表征
耐酸性实验显示，在pH 2、3和4条件下暴露3 h后，两菌株均保持活力，整个实验期间无统计学显著差异。胆汁盐耐受性实验显示，两菌株在高达2%（w/v）的胆汁盐浓度下均保持活力，两菌株间无显著差异。渗透压胁迫实验显示，在2.5%（w/v）NaCl条件下两菌株生长均受损，但突变株表现出略高的生长速率；在3.0%和3.5%（w/v）NaCl条件下，两菌株均受到显著生长抑制。EPS产生实验确认两菌株在葡萄糖、果糖、蔗糖和乳糖为唯一碳源时均为EPS产生菌，菌落形态无差异。自聚集实验显示，1 h时BLC01和BLC01-2F3G10的聚集率分别为73.11%和73.39%，4 h时分别达到79.75%和83.30%，两菌株间无统计学显著差异。共聚集实验显示两菌株与肠道病原菌鼠伤寒沙门氏菌（*Salmonella enterica*）和大肠杆菌（*Escherichia coli*）的共聚集能力均较低且多变。INFOGEST静态体外消化实验显示，两菌株在胃肠道转运过程中均表现出高存活率，消化各阶段细菌载量均保持在约8 log CFU/mL，无显著差异。Caco-2细胞黏附实验显示，两株双歧杆菌与阳性对照鼠李糖乳酪杆菌（*Lacticaseibacillus rhamnosus*）ATCC 53103（GG）的黏附水平无显著差异，其中BLC01-2F3G10黏附率最高（90.56%），阴性对照德氏乳杆菌乳亚种（*Lactobacillus delbrueckii* subsp. *lactis*）DSM 2072黏附率显著较低（6.63%）。HT-29细胞黏附实验（real-time PCR定量）显示，BLC01和BLC01-2F3G10的黏附水平分别为GG的10.45倍和8.74倍，两株双歧杆菌间无统计学显著差异。
#### 3.4 tetW突变株的稳定性
为评估编辑菌株的遗传稳定性，研究人员在高于已报道最低选择性浓度（minimal selective concentration，MSC）0.01 μg/mL但低于MIC的四环素浓度（0.1和0.5 μg/mL）下传代培养122代。编辑后的菌株在0.1和0.5 μg/mL四环素浓度下正常生长，但未检测到能够在8 μg/mL临界值浓度下生长的回复突变菌落，表明编辑后表型具有遗传稳定性。
### 五、讨论与结论总结
讨论部分指出，广泛存在的ARGs（如tetW）使益生菌可能成为肠道水平ARGs传播的潜在贡献者。本研究成功利用内源性Type I-U CRISPR-Cas系统在tetW中引入精确终止密码子，确认并扩展了此前双歧杆菌内源性CRISPR基因组编辑的报道。与先前主要集中于基因删除的研究不同，本研究采用最小化、明确界定的序列修饰消除抗性，这类编辑方式减少了非预期基因组效应的可能性，有利于监管和安全评估。全基因组测序几乎完全排除了CRISPR相关的脱靶突变，单一额外突变（lgt基因）未导致Lgt蛋白预测结构或菌株表型行为的可检测变化，支持该突变的生物学中性。重要的是，BLC01-2F3G10不含任何外源DNA，进一步增强了其生物安全特性。四环素MIC从32 μg/mL急剧降至1 μg/mL，证实tetW在赋予四环素抗性中的重要作用。生长动力学实验进一步证实编辑菌株无法耐受不损害亲本菌株的抗菌药物浓度。在无抗菌药物条件下，抗性消除未导致适应性降低，表明tetW不参与基础细胞生理。应激耐受特性的维持是益生菌表征的基本要求。BLC01-2F3G10表现出与BLC01相当的耐酸、耐胆汁和耐渗透压能力，即使在比文献中通常报告更严格的条件下。两菌株在模拟胃液和肠液中均保持高存活率。观察到的表型等效性符合EFSA对基因修饰微生物风险评估的指南要求。表面相关特性在宿主-微生物互作中起关键作用。EPS产生的保守性表明遗传干预未干扰多糖生物合成通路。两菌株的高自聚集水平使其跻身高性能双歧杆菌之列。tetW失活未引入聚集行为的可检测变异或不稳定性。虽然与病原菌的共聚集能力有限，但该特性高度依赖菌株。体外黏附实验显示BLC01-2F3G10对Caco-2和HT-29细胞的黏附与亲本菌株和阳性对照相当，表明tetW失活未损害与宿主互作相关的表面特性。在抗性去除策略的关键安全方面——抗菌药物敏感表型的长期稳定性——引入终止密码子导致的功能丧失通过连续传代后无回复突变得到确认。由于消除了可移动且广泛保守的ARG而未引入新的耐药决定因子，编辑菌株降低了肠道生态系统中水平基因转移的理论风险。从转化应用角度看，本研究展示了NGTs如何整合到益生菌开发的SbD框架中——该修饰针对已知安全关切而非增强功能，同时保留了益生功效所必需的特性。虽然本研究在动物双歧杆菌乳亚种中得以验证，但该方法可能扩展到其他携带特征明确的ARGs的益生菌类群，前提是存在合适且经过表征的内源性CRISPR-Cas系统。
研究结论指出，基于内源性CRISPR的编辑可被有效用作精确安全工具，在不损害功能性能的前提下重塑益生菌抗性组。该策略为开发既有效又符合不断演进的监管和社会期望的下一代益生菌提供了通用框架。
