引言
半胱氨酸（Cys）是一种含硫氨基酸，在生物系统中发挥着至关重要的作用，通过调控生理和病理过程维持生命活动的正常进行 [1], [2], [3], [4]。其正常细胞内浓度范围为30至200 μM [5], [6]。Cys水平异常与多种疾病相关：Cys过量可导致肾结石、心血管疾病和帕金森病 [7], [8], [9], [10], [11]，而Cys缺乏则可能导致免疫功能受损、氧化应激以及皮肤和毛发等组织的退化 [12], [13], [14]。因此，开发高效灵敏的Cys检测方法具有重要意义。传统的分析技术，如气相色谱（GC）[15]、高效液相色谱（HPLC）[16], [17]、伏安法 [18] 和毛细管电泳（CE）[19]，虽然有效，但通常受限于其高昂的成本、复杂的仪器和耗时的样品制备。相比之下，基于荧光的传感技术因其简单、成本低、灵敏度高以及能够实时监测而受到越来越多的关注 [15], [16], [17], [18], [19], [20], [21], [22], [23], [24], [25]。在识别单元中，7-硝基-1,2,3-苯并噁二唑（NBD）因其强吸电子特性而备受关注，该特性可通过供体-受体光诱导电子转移（d-PET）途径促进荧光猝灭。当与Cys反应时，NBD部分的裂解会破坏这种供体-受体相互作用，从而抑制 d-PET 途径并恢复发光态的PI状态。 [21], [26], [27], [28], [29], [30], [31]。近年来开发了多种用于检测半胱氨酸的荧光探针，但其中许多仍存在检测限较高或响应时间较慢的问题。例如，一种基于BODIPY的开型探针表现出良好的选择性和相对快速的响应，但其检测限仍高于本研究的体系 [32], [33], [34]。一种基于喹啉鎓型的关型传感器报道的检测限为0.18 μM，高于本研究获得的检测限 [33]。另一种探针BTAB（3-(2H-苯并[d][1,2,3]三唑-2-基)-2-氧代-2H-苯并[g]吡喃-8-基丙烯酸酯）采用丙烯酸酯反应位点检测Cys，表现出良好的选择性，但未达到纳摩尔级的检测限 [35]。最后，一种为食品样品分析而设计的咔唑-吡啶“开型”探针（CPI）达到了微摩尔级的检测限（3.8 μM）[36]。相比之下，本研究的探针 PI-NBD 具有9.25 nM的超低检测限、5 min内的快速响应，以及能够实现Cys与Hcy和GSH区分的发射双通道行为。在生物相关硫醇中，半胱氨酸（Cys）、同型半胱氨酸（Hcy）和谷胱甘肽（GSH）具有结构相似性，使得它们的选择性识别成为一项主要分析挑战 [37], [38]。为解决这一问题，设计了各种荧光探针用于生物硫醇的选择性或同时检测 [39], [40], [41], [42], [43], [44], [45], [46], [47]。最被广泛利用的传感机制包括Michael加成 [48], [49], [50]、磺酰胺或磺酸酯裂解 [51], [52]、二硫键交换 [53]、醛诱导的环化 [54], [55], [56], [57] 和亲核取代 [58], [59], [60], [61], [62]。
在本工作中，我们报道了一种荧光发色传感器的设计与合成，该传感器将7-硝基苯并-2-噁二唑（NBD）部分整合到4-(1H-菲[9,10-d]-亚胺-2-基)苯酚（PI）骨架中，形成 PI-NBD 共轭物。分子设计将菲咯啶亚胺（PI）荧光团的固有荧光与NBD部分成熟的硫醇响应特性整合于单一分子结构中。当与半胱氨酸反应时，硫醇触发的亲核加成启动反应序列，最终导致NBD醚键的裂解以及相应NBD–Cys加合物的形成，同时释放出荧光团PI。因此，本研究并非引入全新的硫醇反应化学，而是探索了一种能够实现双通道荧光信号并提供传感反应直接光学读数的 PI-NBD 分子平台。光谱、选择性和理论研究均支持了 PI-NBD 对生物硫醇（尤其是半胱氨酸）的优良灵敏度和选择性。此外，利用活体（Saccharomyces cerevisiae）细胞证明了其在细胞内Cys检测中的应用价值，凸显了该探针在细胞生物成像应用中的潜力。总体而言，菲咯啶亚胺荧光团、基于NBD的硫醇响应性、双通道荧光输出和细胞内传感能力的结合，为半胱氨酸检测荧光探针的发展做出了独特的分子层面和应用层面的贡献。
