《GeroScience》：Retrotransposable element derepression distinguishes DNMT3A-mutant from TET2-mutant clonal haematopoiesis
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克隆性造血（clonal haematopoiesis, CH）由造血干细胞中的体细胞突变驱动，产生可在外周血中检测到的克隆群体，在65岁以上人群中存在率为10%–20%。DNMT3A和TET2突变是最常见的驱动因素，并与炎症表型及血液系统和心血管疾病风险增加
克隆性造血（clonal haematopoiesis, CH）由造血干细胞中的体细胞突变驱动，产生可在外周血中检测到的克隆群体，在65岁以上人群中存在率为10%–20%。DNMT3A和TET2突变是最常见的驱动因素，并与炎症表型及血液系统和心血管疾病风险增加相关。然而，将这些突变与炎症信号联系起来的细胞内在机制仍未完全阐明。由于逆转录转座子（retrotransposable elements, RTEs）受表观遗传调控，并在去抑制时可激活先天免疫通路，研究人员假设RTE再激活可能代表一种将克隆性造血驱动突变与炎症通路联系起来的突变特异性机制。研究人员利用整合的基因组和转录组方法，分析了来自56名CH个体和12名非CH对照的外周血单核细胞（peripheral blood mononuclear cell, PBMC）样本中的RTE表达和克隆负荷，并通过跨造血谱系的TARGET-seq进行了补充验证。高变异等位基因频率（variant allele frequency, VAF；>10%）的DNMT3A突变克隆表现出广泛的RTE去抑制，尤其是LINE和LTR家族，而TET2突变克隆则相对于对照组表现出RTE表达降低的趋势。转录组分析显示，具有高RTE表达的DNMT3A高VAF克隆富集了炎症信号通路，包括TNF-α/NF-κB信号、干扰素反应和衰老相关特征。相比之下，TET2突变克隆缺乏这些RTE相关的炎症特征，而是富集了氧化磷酸化、活性氧信号和雷帕霉素机制靶蛋白复合物1通路。这些发现在独立队列中得到了重复。总的来说，研究结果强调了克隆性造血中突变特异性的炎症机制，并为未来的功能和临床前研究奠定了基础，以确定调节RTE活性是否能影响DNMT3A突变CH的炎症表型并代表一种潜在的治疗策略。
**一、研究背景与科学问题**
克隆性造血（clonal haematopoiesis, CH）由造血干细胞中的体细胞突变驱动，产生可在外周血中检测到的突变细胞克隆群体（变异等位基因频率>2%），在65岁以上人群中存在率为10%–20%。随着全球人口老龄化加剧，CH相关并发症的风险人群规模将持续扩大。DNMT3A和TET2突变是CH最常见的驱动因素，已被证明与髓系细胞炎症反应增强及血液系统疾病和心血管疾病风险增加相关。然而，将这些突变与炎症信号联系起来的细胞内在机制仍不完全清楚。逆转录转座子（retrotransposable elements, RTEs）作为表观遗传调控的元件，在去抑制时可激活先天免疫通路，其在衰老中的去抑制已被认定为衰老的标志之一。DNMT3A和TET2作为表观遗传调控因子，对DNA甲基化发挥相反作用：DNMT3A突变导致基因组轻度低甲基化，TET2突变则导致高甲基化。尽管两种基因的功能缺失突变均驱动免疫激活，但近期研究显示它们在阿尔茨海默病发病和COVID-19感染后表现出相反的效应，提示DNA甲基化之外还存在额外机制。研究人员假设RTE再激活可能是连接特定CH驱动突变与炎症通路激活的机制性桥梁。鉴于DNMT3A和TET2突变在CH中的高 prevalence 及其临床异质性尚未得到充分解释，阐明RTE表达模式及其与CH突变的关联，对理解RTE在炎症、衰老和年龄相关疾病表型中的作用具有重要科学意义。
**二、研究内容与主要结论**
研究人员分析了来自68名接受择期髋关节置换术的健康老年个体的外周血单核细胞（PBMC）样本，基于DNMT3A和TET2突变状态将样本分为五组：DNMT3A突变高VAF组（>10%，n=10）、DNMT3A突变低VAF组（≤10%，n=30）、DNMT3A/TET2双突变组（n=9）、TET2突变组（n=7）和非CH对照组（n=12）。研究发现：高VAF DNMT3A突变克隆表现出广泛的RTE去抑制，尤其是LINE和LTR家族；TET2突变克隆则表现出RTE表达降低的趋势。转录组分析显示，DNMT3A高VAF且RTE高表达克隆富集了TNF-α/NF-κB信号、炎症反应和衰老相关通路；而TET2突变克隆缺乏RTE相关的炎症特征，反而富集氧化磷酸化、活性氧（ROS）信号和mTORC1通路。双突变体处于中间状态。上述发现在独立RNA-seq验证队列中得到了重复。该研究首次系统揭示了CH中DNMT3A与TET2突变通过截然不同的分子机制驱动炎症——前者通过RTE去抑制激活炎症和衰老程序，后者通过代谢和氧化还原失调驱动炎症，为开发突变特异性的生物标志物和治疗策略奠定了理论基础。
**三、主要关键技术方法**
研究人员采用了以下核心技术方法：（1）靶向髓系基因测序：使用定制化髓系靶向测序面板对PBMC基因组DNA进行分析，平均目标覆盖率>300×（双链共有序列）和>1000×（单链共有序列），通过包含唯一分子标识符（UMI）和多种变异调用软件的错误校正流程鉴定体细胞突变；（2）RNA测序与RTE表达定量：采用无poly(A)选择的链特异性总RNA文库制备方案进行测序，平均每样本产生6510万条150-bp双端读段，使用featureCounts对RepeatMasker注释区域进行RTE表达定量，以规则化对数变换（rlog）标准化；（3）差异表达分析与基因集富集分析（GSEA）：使用DESeq2进行基因和RTE亚家族的差异表达分析，设计公式包含批次、性别、年龄和分组协变量，使用clusterProfiler结合Hallmark和Reactome基因集进行通路富集分析；（4）基因签名评分：通过文献综述制定干扰素调控基因（IRG）、TNF、衰老和SASP共识基因集，应用singscore基于秩的方法计算签名评分；（5）TARGET-seq单细胞验证分析：使用来自Jakobsen等人的公开TARGET-seq数据（EGA: EGAS00001007358），包含5例DNMT3A突变和3例TET2突变样本，按细胞类型注释聚合生成伪批量（pseudobulk）图谱，使用DESeq2进行差异表达检验；（6）独立验证队列分析：重新分析了Smith等人（GSE263013）的92名健康中老年PBMC RNA-seq数据，使用RNAVAR进行体细胞突变 calling，鉴定出7例DNMT3A高VAF和6例TET2突变病例进行验证。样本来源于伦敦国王学院医院和罗伯特·琼斯与艾格尼丝·亨特骨科医院的人群健康老龄化研究队列（n=738），经伦敦-布卢姆斯伯里研究伦理委员会批准。
**四、研究结果**
**1. 高VAF DNMT3A突变与异质性RTE去抑制相关**
研究人员首先建立分析框架，通过DESeq2差异表达建模和rlog标准化分析RTE表达谱。按VAF分层显示，高VAF（>10%）DNMT3A克隆表现出最显著的RTE亚家族变化，其中多数上调的RTE亚家族属于LINE:L1和LTR:ERV1/ERVL家族。使用基因组DNA来源的VAF进行敏感性分析得到一致结果。值得注意的是，RTE家族表达分析识别出两个不同的高VAF亚组：一个RTE表达显著升高，另一个与非CH对照组水平相似，表明高VAF DNMT3A突变群体内部存在显著异质性。
**2. RTE表达和突变位点将DNMT3A突变克隆分层为不同的炎症表型**
将所有DNMT3A突变病例按RTE表达高低分层后，发现DNMT3A突变群体内部存在显著的异质性和突变位点特异的RTE表达模式。PWWP结构域突变 exclusively 与RTE高表型相关，而甲基转移酶结构域内大多数高VAF突变也表现出RTE高表达，但复发性R882H热点突变聚集在RTE低表达组。全转录组分析显示，RTE高表达的DNMT3A高VAF克隆富集了TNF–NFκB和炎症反应等Hallmark炎症信号通路，效应层面TNF和S100A9表达显著升高，多个干扰素调控基因（IRG）上调。此外还观察到人沉默枢纽（HUSH）介导的沉默和Sirtuin 1（SIRT1）介导的rRNA调控通路富集，可能代表对DNMT3A相关表观遗传扰动的代偿性反应。低VAF DNMT3A病例中，无义突变在RTE高表达克隆中富集，RTE高表达克隆主要与衰老通路相关。共突变分析显示，40例DNMT3A突变病例中仅4例（10%）存在复发性共突变，且在RTE高表达组或高VAF组中无富集，排除了共突变对异质性的主要贡献。
**3. TET2突变抑制反转录转座子**
与非CH对照组相比，TET2突变克隆多个RTE家族表达呈降低趋势。亚家族水平差异表达分析显示，在全部三组比较中（TET2 vs 双突变、TET2 vs DNMT3A低VAF、TET2 vs DNMT3A高VAF），TET2突变病例均表现出RTE亚家族的下调，与DNMT3A高VAF克隆的差异最为显著。TARGET-seq单细胞数据分析显示，在个体造血细胞类型中，DNMT3A突变病例包含更多上调的RTE亚家族，红系和巨核细胞谱系富集最强，其中ERV1、ERVL、ERVL–MaLR和L1家族贡献最大。通路分析显示，TET2突变体相对DNMT3A低VAF富集氧化磷酸化、ROS和mTORC1信号，相对DNMT3A高VAF富集ROS信号和干扰素-α反应。双突变体处于中间位置：相对TET2突变体趋向于更高RTE表达，相对DNMT3A高VAF则明显更低，且TNF–NFκB和干扰素程序较DNMT3A突变减弱。
**4. RTE表达与炎症和衰老特征相关**
通过线性回归将RTE家族表达与四个精选签名评分（IRG、TNF–NFκB、衰老、SASP）关联分析，DNMT3A高VAF病例中RTE表达与全部四个签名显著正相关。DNMT3A低VAF病例中，IRG和衰老存在显著正相关，TNF–NFκB和SASP效应较弱且不一致。TET2突变病例中未观察到与任何签名的显著关联。独立验证队列中，DNMT3A高VAF克隆的RTE表达与干扰素、TNF–NFκB和衰老通路显著相关，而TET2突变病例未显示显著相关性。
**五、讨论与结论**
讨论部分指出，DNMT3A和TET2突变合计占所有CH变异的约70%。研究揭示DNMT3A突变与广泛的RTE去抑制相关，高VAF克隆主要上调LINE:L1和LTR:ERV1/ERVL亚家族，表明DNA甲基化破坏和逆转录转座子沉默失效。RTE去抑制与先天免疫和炎症通路激活相关，高RTE样本中干扰素刺激基因（ISG15、IFI44、IFIT1、IFIT2、IFIT3）显著上调，符合RTE来源RNA/cDNA激活胞质传感器（cGAS）导致I型干扰素反应的模型。TET2突变克隆则以独立于RTE的方式通过代谢/炎症小体通路驱动炎症。双突变克隆的中间表型支持DNMT3A和TET2在调控RTE活性和免疫信号中的非冗余甚至拮抗作用。研究局限性包括：批量PBMC RNA测序可能受细胞组成差异影响；高VAF病例数量有限（n=10）限制了对突变位置和克隆结构效应的推断强度；数据仅证明RTE去抑制与炎症通路激活之间的关联而非因果关系。
研究结论明确指出：克隆性造血中的炎症具有突变特异性。DNMT3A突变，尤其是高VAF克隆，与逆转录转座子去抑制及炎症和衰老通路相关；而TET2突变克隆的炎症程序与代谢和氧化还原失调相关，而非逆转录转座子激活。这些结果凸显了不同CH基因型驱动炎症的独特生物学机制，为开发突变特异性生物标志物和治疗策略提供了框架。
