HIF1α-KLF4信号轴驱动肝细胞癌中红细胞外血红蛋白表达并赋予索拉非尼耐药性

《Signal Transduction and Targeted Therapy》：HIF1α-KLF4 signaling dictates extra-erythrocyte expression of hemoglobin conferring sorafenib resistance in hepatocellular carcinoma

　　

### 摘要专业翻译
癌细胞必须应对过量的活性氧（reactive oxygen species，ROS）才能在严重缺氧和抗癌治疗中存活；然而，除了众所周知的NFE2L2/NRF2信号通路之外，其他抗ROS机制鲜为人知。本研究报告了一种由HIF1α-KLF4诱导的血红蛋白（hemoglobin，Hb）在肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）中红细胞外表达所介导的ROS清除机制。研究人员发现，ROS通路在HCC中被异常激活，并与血红蛋白上调相关，后者可独立预测不良预后。通过网络分析进一步确定血红素结合（heme binding）为排名最高的ROS相关功能模块，提示血红蛋白在维持HCC氧化还原稳态中具有此前未被认识的作用。癌细胞中血红蛋白的表达由HIF1α通过KLF4进行转录调控，而非HIF2α或近期发现的KDM5A-KLF1信号。上调的血红蛋白通过清除ROS来抵消氧化应激的有害影响，从而促进索拉非尼耐药，而干扰血红蛋白表达可有效逆转该效应，进而抑制肿瘤。体外和体内实验均一致支持血红蛋白在调节氧化应激适应和治疗反应中的功能重要性。总体而言，该研究确定了癌细胞在氧化应激下生存的一种此前未被认识的机制，其中HIF1α-KLF4信号诱导血红蛋白清除缺氧和抗癌治疗过程中产生的ROS，为癌症治疗提供了一个有前景的合成致死（synthetic lethality）靶点。

### 论文解读文章
**研究背景与科学问题**

实体瘤因快速无控制的增殖，常因血管生成和氧气供应相对不足而面临局部缺氧。多项研究表明，肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）组织处于极度缺氧状态，这有助于癌细胞增强血管生成、恶性程度和耐药性。缺氧主要通过缺氧诱导因子（hypoxia-inducible factors，HIFs）激活一系列信号转导级联，调控基因表达网络以应对缺氧相关的不利影响，例如过量活性氧（reactive oxygen species，ROS）引起的氧化应激。在氧化还原信号研究领域，NF-E2 p45相关因子2（NRF2）通路被公认为多种背景下氧化应激反应的主要调控者。然而，除NRF2信号外，确实存在其他抗ROS机制，以适应生物学背景的多样性和复杂性，但这类非NRF2氧化还原系统至今仍未得到充分阐明。血红蛋白是红细胞中高表达的特化蛋白，主要功能是携带氧气。在缺氧条件下，巨噬细胞、视网膜色素上皮细胞和内皮细胞等非红细胞中也检测到血红蛋白表达，但其功能需根据具体背景进一步研究。研究人员此前在软骨细胞中发现血红蛋白，其上调对缺氧有响应，且依赖于KDM5A-KLF1信号而非HIF1/2α通路。这些研究表明，红细胞外的血红蛋白具有组织特异性的功能和调控机制。本研究旨在探索HCC中是否存在不同于上述已知通路的抗ROS机制，并明确血红蛋白在HCC病理过程中的作用。

**主要技术方法**

研究人员利用癌症基因组图谱（The Cancer Genome Atlas，TCGA）公共数据库的HCC样本表达谱，结合分子特征数据库（Molecular Signatures Database，MSigDB）参考基因集，通过单样本基因集富集分析（single-sample gene set enrichment analysis，ssGSEA）、LASSO Cox回归和多元Cox回归筛选与预后相关的通路；采用加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）构建 ROS相关共表达网络。利用公共单细胞RNA测序数据集GSE125449（包含9例HCC患者）进行细胞聚类注释，并结合拷贝数变异分析以确认恶性细胞身份，利用多重免疫荧光染色验证临床组织样本。通过染色质免疫沉淀测序（chromatin immunoprecipitation sequencing，ChIP-seq）和染色质免疫沉淀定量PCR（ChIP-qPCR）鉴定HIF1α靶基因及结合位点，通过双荧光素酶报告基因实验验证调控元件。在细胞系（Hep3B 2.1-7、SNU 387、Huh 7、HepG2、QGY-7703、SMMC-7721、BEL-7402、PLC/PRF/5、SNU182、SNU387）和雄性NCG小鼠异种移植瘤模型中开展体内外功能实验。利用流式细胞术检测ROS水平和细胞凋亡，通过CCK-8实验评估细胞活力，通过蛋白质印迹法检测蛋白表达。

**研究结果**

***ROS通路的激活预示HCC预后不良。*** 通过对TCGA数据库中HCC样本进行50种癌症相关特征通路评分，单因素Cox回归分析确定了6个与患者生存显著相关的通路；LASSO回归和多元Cox回归进一步确认ROS通路、PI3K–AKT–mTOR通路和凝血通路为独立预后因素，其中ROS通路是影响最大的风险因素。随后，通过WGCNA构建无标度共表达网络，鉴定出一个包含647个基因的黄色模块，与ROS评分强相关，被命名为“ROS相关模块”。该模块基因显著富集于ROS相关通路。将ROS模块基因与癌组织和非癌组织间的差异表达基因取交集，得到38个特征基因，据此将患者分为两个聚类。其中聚类2的ROS ssGSEA评分显著更高，且患者总生存期显著更短。

***血红蛋白表达与ROS通路相关。*** 基因本体论（Gene Ontology）分析鉴定了一组与ROS通路激活相关的分子功能条目，其中“血红素结合”被确定为排名最高的功能模块。与之对应，HBA和HBB（血红蛋白的两个亚基）在HCC组织中表达，且在ROS高表达的聚类2中显著升高。TCGA数据库和组织芯片（tissue microarray，TMA）的Kaplan-Meier分析均显示，HBA或HBB高表达的HCC患者总生存期显著缩短。多元分析提示HBA/HBB的预后价值可能具有背景依赖性，这促使研究人员进一步探索其在HCC发病机制中的功能作用。

***血红蛋白在恶性HCC细胞中表达。*** 为规避其他细胞类型（如血管内皮细胞）中血红蛋白表达的潜在混杂影响，研究人员对9例HCC患者的单细胞测序数据进行聚类注释，共鉴定出8个主要细胞群。分析显示，血红蛋白表达主要富集于恶性细胞和肝祖细胞样细胞群。拷贝数变异分析确认了表达HBA/HBB的细胞群的恶性身份。该细胞群不共表达经典红细胞标志物，且在严格去除双细胞后信号依然存在，有效排除了红细胞污染。不同患者中血红蛋白阳性恶性细胞比例存在差异，提示存在瘤间异质性。独立HCC患者病理标本的空间分布验证进一步证实了血红蛋白的恶性细胞特异性表达谱。

***HIF1α依赖性上调HCC细胞中的血红蛋白。*** 在调控机制研究中，ssGSEA分析显示NRF2通路与HCC中ROS活性的关联较弱，且NRF2敲低并未改变血红蛋白表达。相反，HIF1α信号被确定为排名最高的候选通路，基因集富集分析（gene set enrichment analysis，GSEA）证实缺氧信号在ROS高表达聚类中显著富集。在大多数肝癌细胞系中，缺氧诱导HBA和HBB表达，同时HIF1α蛋白水平升高。利用HIF稳定剂罗沙司他（roxadustat，FG-4592）处理可有效上调血红蛋白及HIF1/2蛋白水平。在缺氧条件下，外源性表达HIF1α而非HIF2α能诱导血红蛋白和VEGF表达；反之，敲低HIF1α而非HIF2α会使细胞对缺氧诱导的血红蛋白上调失去响应。这些数据表明缺氧通过HIF1α上调血红蛋白。

***血红蛋白表达不依赖KDM3A和KLF1。*** 为解析HIF1α依赖性血红蛋白调控机制，研究人员进行了靶向HIF1α和HIF2α的ChIP-seq实验。在血红蛋白基因座及其推定转录调控元件上未检测到显著的HIF1α/2α结合峰。对HIF1α/2α结合基因进行功能注释，鉴定出7，476个HIF1α特异性转录靶点。在排名前10的HIF1α特异性靶点中，KDM3A被优先用于功能验证，因其是与血红蛋白调控因子KDM5A具有同源性的JmjC结构域去甲基化酶。然而，无论在常氧还是缺氧条件下，外源性KDM3A过表达均未能调节血红蛋白转录。尽管外源性过表达KLF1能强烈诱导血红蛋白表达，但HCC细胞中内源性KLF1蛋白几乎检测不到，且KLF1 mRNA无低氧响应性上调。这些数据表明，HCC中存在不同于KDM3A和KLF1通路的新的血红蛋白调控机制。

***HIF1-KLF4依赖性血红蛋白表达。*** 鉴于Krüppel样因子（KLF）家族在红系成熟和血红蛋白表达中的关键调控功能，研究人员系统分析了KLF基因表达谱与血红蛋白转录物的相关性。多元回归分析确定了KLF2、KLF4和KLF10与血红蛋白表达正相关。HIF1α依赖性转录靶点的差异表达分析显示KLF4和KLF5显著富集。功能验证表明，在候选KLFs中，只有KLF4能显著增强血红蛋白转录。敲低KLF4显著抑制血红蛋白表达。ChIP-qPCR证实KLF4直接结合HBA和HBB基因座的调控区。HIF1α敲低可特异性消除低氧诱导的KLF4上调。通过对HIF1α ChIP-seq峰进行从头基序分析，在KLF4基因座内鉴定出10个潜在结合位点，ChIP-qPCR验证了3个功能性HIF1α结合元件（一个位于近端启动子区，两个位于第二外显子）。双荧光素酶报告基因实验证实近端启动子内的HIF1α结合位点对低氧条件下KLF4表达驱动至关重要。综合这些结果，研究人员确立了HIF1α-KLF4轴作为调控HCC细胞血红蛋白表达的缺氧响应转录轴。

***血红蛋白降低细胞内ROS水平。*** 利用DCFH-DA荧光探针结合流式细胞术检测发现，单独或联合敲低两种血红蛋白亚基均增加DCF阳性细胞数，且在缺氧条件下进一步增强；而血红蛋白过表达则显著增加DCF阴性细胞数。使用线粒体超氧化物探针MitoSOX Red和通用ROS探针二氢乙啶（DHE）的检测结果一致。血红蛋白的ROS降低作用依赖于血红素，用琥珀酰丙酮（succinylacetone，SA）抑制血红素合成可减弱该功能。血红蛋白敲低引起的ROS升高幅度与敲低过氧化氢酶（CAT）或GPX4等经典抗氧化酶相当。共聚焦显微镜显示，表达HBA-mCherry或HBB-mCherry的细胞其DCF强度显著低于邻近对照细胞。体外实验表明，与纯化血红蛋白蛋白共孵育可显著降低H?O?和超氧阴离子水平。由此证明血红蛋白作为清除剂可降低细胞内ROS水平。

***血红蛋白保护细胞免受氧化应激诱导的死亡。*** CCK-8实验显示，血红蛋白敲低显著抑制癌细胞生长，缺氧条件下抑制作用进一步增强。ROS清除剂依达拉奉（edaravone）和乙酰半胱氨酸（NAC）可挽救这种生长抑制。在细胞死亡抑制剂中，细胞凋亡抑制剂Z-VAD-FMK和CASP3敲低可有效挽救血红蛋白缺失诱导的生长抑制，而铁死亡抑制剂ferrostatin-1和坏死性凋亡抑制剂necrostatin-1几乎没有挽救效果。流式细胞术显示，ROS清除剂和细胞凋亡抑制剂显著抑制了缺氧条件下血红蛋白缺失细胞的凋亡。自噬抑制剂3-甲基腺嘌呤（3-MA）未恢复细胞生长。这些结果表明血红蛋白保护癌细胞免于缺氧引起的氧化应激诱导的细胞凋亡。

***抑制血红蛋白可突破索拉非尼耐药。*** 在临床样本分析中，索拉非尼无应答者肿瘤中的血红蛋白表达显著高于应答者。血红蛋白敲低使索拉非尼的半数抑制浓度（IC??）降低近一半，并显著提高细胞内ROS水平及细胞凋亡率。ROS清除剂或凋亡抑制剂可恢复血红蛋白缺失细胞在索拉非尼处理下的生长。类似增敏作用在仑伐替尼（lenvatinib）处理中也观察到。虽然脂质过氧化等铁死亡指标略有升高，但铁死亡抑制剂仅提供极小的保护，提示细胞凋亡是主要的死亡模式。血红蛋白敲低未改变索拉非尼诱导的AKT磷酸化，但显著增强了ERK1/2（MAPK）激活，表明增敏作用并非通过协同抑制索拉非尼的经典激酶靶点，而是通过参与不同的应激反应轴实现。体内异种移植模型证实，血红蛋白敲低显著增强了索拉非尼对肿瘤生长的抑制。

**讨论与结论**

本研究在HCC中鉴定出一种由HIF1α-KLF4转录轴调控的HCC特异性血红蛋白表达机制。这种红细胞外血红蛋白作为ROS清除剂保护癌细胞免受氧化应激诱导的细胞凋亡，从而赋予索拉非尼耐药性。与软骨细胞中KDM5A-KLF1信号调控的氧供功能不同，HCC中的血红蛋白受HIF1α-KLF4轴驱动，且不依赖KDM5A和KLF1，该发现拓展了人们对非红细胞血红蛋白功能的认识。KLF4在肿瘤耐药中的功能此前鲜有报道，该发现扩展了该转录因子的功能谱。血红蛋白高表达与不良预后相关，可视为肿瘤成功适应高应激微环境的标志。靶向血红蛋白可破坏氧化还原平衡，与索拉非尼和仑伐替尼等ROS诱导疗法产生协同效应。研究还发现血红蛋白敲低主要诱导细胞凋亡而非铁死亡，提示血红蛋白在决定细胞死亡方式中具有背景依赖性作用。研究结论部分指出：该研究确定了一种独立于NRF2的HCC特异性抗ROS机制，即HIF1α-KLF4转录轴调控的血红蛋白表达；这种红细胞外血红蛋白通过清除ROS保护癌细胞免于氧化应激诱导的凋亡，赋予索拉非尼耐药性。研究不仅揭示了此前未被认识的抗ROS机制，还将血红蛋白确立为克服HCC耐药性的潜在治疗靶点，为在其他恶性肿瘤中研究血红蛋白的非经典功能提供了研究框架。该发现为HCC的氧化还原适应提供了可靶向的分子轴，并为探索血红蛋白在其他癌症类型中的非经典作用奠定了基础。