定量蛋白质组学揭示复制性衰老进程中蛋白质组的协同性重塑与蛋白质稳态网络失调

《Nature Communications》：Quantitative proteomics reveals coordinated changes in the proteome during replicative senescence

　　

细胞衰老（cellular senescence）是一种由端粒侵蚀、持续性DNA损伤或慢性应激触发的不可逆细胞周期停滞状态。衰老细胞的积累会破坏组织功能并促进衰老和疾病的发生。本研究采用基于质谱（MS）的蛋白质组学技术，系统性地探究了复制性细胞衰老进程中多个层面的动态蛋白质组变化。研究人员证明，衰老过程中的蛋白质组变化以协同方式发生，其特征是染色质上蛋白质的广泛耗竭。此外，细胞质翻译机器的组分出现耗竭，而线粒体蛋白则表现出溶解度降低。衰老细胞中自噬和蛋白酶体活性受损，同时伴随泛素链连接方式的重塑以及泛素E3连接酶的耗竭。将衰老蛋白质组与不同病理生理细胞状态进行比较，揭示了一种由蛋白质稳态网络变化塑造的独特衰老特征。综上所述，本研究为探索衰老蛋白质组中时间分辨性变化提供了数据资源。

**论文解读**

**研究背景与意义**

细胞衰老是衰老的标志性特征（hallmark of aging），也是慢性炎症及年龄相关疾病的重要驱动因素。衰老细胞在老化组织中积累，导致局部组织功能障碍和慢性炎症，最终产生有害的系统性效应。尽管衰老细胞表现出异质性特征，但它们共享某些共同属性，包括不可逆的细胞周期停滞、对凋亡的抵抗、以衰老相关分泌表型（SASP）为特征的炎症因子分泌，以及p16^INK4a/Rb和/或p53/p21^CIP1肿瘤抑制因子等衰老标志物的表达。除端粒缩短和持续性DNA损伤应答导致的复制性衰老外，慢性应激、线粒体功能障碍和癌基因激活也可触发衰老。

然而，此前的研究主要集中于衰老过程中转录组的变化，对复制性衰老进程中蛋白质组及相关翻译后修饰（PTMs）的详细特征，尤其是在时间维度上的解析，仍十分匮乏。此外，衰老过程中主要细胞降解机器——泛素-蛋白酶体系统（UPS）和自噬-溶酶体途径——的活性与水平仍存在争议。基于此，研究人员开展了这项系统性研究，利用基于质谱的定量蛋白质组学技术，全面描绘了复制性衰老过程中蛋白质组、泛素和SUMO2/3修饰蛋白质组以及蛋白质溶解度的动态变化，为理解衰老的分子机制和开发靶向衰老细胞的治疗干预策略提供了重要资源。该研究发表于《Nature Communications》。

**关键技术方法**

本研究以培养的人胚肺成纤维细胞IMR90为复制性衰老模型，选取四个连续阶段（群体倍增数PD＜32、40±2、50±2和＞60，分别称为年龄1至年龄4）。核心技术方法包括：采用TMTpro^TM 16plex等量异位标记结合数据依赖采集（DDA）模式的定量蛋白质组学；基于数据非依赖采集（DIA）模式的无标记定量蛋白质组学；使用OtUBD探针在变性条件下富集泛素化蛋白；利用抗SUMO2/3抗体在变性条件下富集SUMO2/3修饰蛋白；基于SureQuant^TM靶向质谱技术定量泛素链连接类型；采用去污剂分级分离法评估蛋白质溶解度；以及RNA测序用于转录组分析。

**主要研究结果**

**染色质相关蛋白的持续耗竭是复制性衰老的特征**

研究人员定量分析了5923种蛋白质，其中14%在衰老过程中发生显著变化，且这些变化遵循不同的时间模式。65%的差异调控蛋白丰度下降，表明蛋白质耗竭是细胞衰老的普遍特征。约三分之二的显著耗竭蛋白定位于细胞核，且这一核蛋白的耗竭在蛋白质组而非转录组层面表现明显。半数以上的耗竭蛋白具有与染色质结合的倾向（其"间期染色质概率指数"大于0.7）。核蛋白的耗竭以协同方式发生：涉及转录、染色质组织和RNA加工的蛋白复合物（如RNA聚合酶II、SMC复合物和17S U2 snRNP）较早丢失，而与DNA复制和复制应激相关的蛋白（如POLA1、RFC3、RFC5、PRIM和CHEK1）则较晚丢失。类似的时间协调性也体现于组蛋白：所有核心组蛋白早期即发生耗竭，而H1连接组蛋白则在晚期才丢失。

**衰老过程中转录和翻译蛋白网络的变化**

在转录调控方面，117种转录因子在衰老过程中发生显著变化，但仅7种丰度增加，包括STAT1、STAT2、TFEB和HMGA2。然而，这些上调转录因子靶基因中超过三分之二的mRNA水平反而下调，表明尽管转录因子丰度增加，它们在衰老细胞中无法完全激活靶基因的表达。值得注意的是，9.5%的显著变化蛋白在mRNA和蛋白质水平之间缺乏相关性。参与RNA聚合酶II转录延伸调控的复合物组分（如PAF复合物、DSIF复合物和超级延伸复合物SEC）尽管mRNA上调，其蛋白水平却出现耗竭。在蛋白质稳态网络方面，超过20%的核蛋白质稳态相关蛋白和11%的细胞核-细胞质蛋白质稳态相关蛋白发生显著变化，包括组蛋白伴侣、核孔复合物和核转运机器组分。细胞质核糖体及其生物发生因子显著耗竭，而停滞核糖体传感器GCN1、泛素E3连接酶RNF14以及参与核糖体停滞事件解决的SKI和ASC复合物成员丰度则出现增加。

**衰老对自噬-溶酶体途径和泛素-蛋白酶体系统的差异性影响**

在主要降解途径中，自噬相关蛋白中超过70%的显著调控蛋白在衰老过程中丰度增加，涵盖自噬的早期（前起始、起始和延伸）和晚期（溶酶体代谢和自噬体成熟）阶段蛋白。然而，通过LC3B脂化评估的自噬通量在衰老细胞中降低，提示自噬相关蛋白的积累可能是由于它们随自噬货物一同被低效降解所致。通过巴弗洛霉素A1（Bafilomycin A₁）阻断自噬的实验显示，线粒体蛋白在自噬抑制后显著富集，表明线粒体是衰老细胞中主要的自噬货物。同时，20S蛋白酶体的糜蛋白酶样、胰蛋白酶样和半胱天冬酶样活性均显著降低，但ATP耗竭并非蛋白酶体活性下降的主要原因。核心蛋白酶体颗粒亚基总体丰度增加，尤其是免疫蛋白酶体亚基PSMB8和PSMB10显著上调，而调控颗粒亚基水平未发生显著变化。

**SUMO2/3修饰蛋白在衰老过程中积累**

SUMO1和SUMO2/3在衰老细胞中显著耗竭，而其他泛素样修饰因子的丰度未发生显著变化。在变性条件下进行的SUMO2/3偶联蛋白pull-down实验鉴定出122种蛋白的SUMO2/3修饰水平增加，其中57%为先前报道的SUMO靶标。定位于PML核体、核散斑体等核凝聚物的蛋白以及拓扑异构酶TOP1/2和衰老相关蛋白HMGA2、LMNA的SUMOylation水平均有所增加。此外，细胞质翻译组分也经历了增强的SUMOylation修饰。鉴于可溶性SUMO2/3在衰老中耗竭，变性条件下SUMO2/3修饰蛋白的积累提示SUMO2/3可能在衰老细胞的不溶性蛋白质组中富集。

**K11和K27连接的泛素化在衰老过程中积累**

尽管总泛素水平未发生显著变化，19种泛素E3连接酶在衰老过程中丰度下降，仅YPEL5、TRIM22和RNF14三种E3连接酶显著上调。通过靶向质谱分析，研究人员发现K11和K27连接的多聚泛素链丰度分别增加高达3.0倍和2.0倍，同时总偶联泛素水平也在衰老中增加。三种去泛素化酶（DUBs）丰度发生显著变化：USP48和USP7下降，而UCHL1上升。

**衰老过程中泛素修饰蛋白质组的分析**

利用OtUBD探针富集泛素化蛋白，研究人员鉴定出250种在衰老细胞中泛素化状态显著变化的蛋白。参与细胞质翻译和核糖体生物发生的蛋白泛素化水平降低。在泛素化水平增加的前10位蛋白中，包括组蛋白伴侣SET、泛素E3连接酶UBOX5和MEX3D、线粒体质量控制激酶PINK1及脂滴组装因子IDAF1。通过MG132或Bortezomib抑制蛋白酶体的实验揭示，RNA聚合酶I、II和III的亚基在增殖和衰老细胞中均受到降解性泛素化修饰，而衰老细胞中选择性被降解性泛素化靶向的蛋白富集于"催化活性"相关类别，包括转录调控因子（TBX3、POLR2E）、RNA加工因子、细胞周期调控因子（CDK1、CCND1）和应激应答MAPK等。

**线粒体蛋白和K27连接泛素化与衰老相关的不溶性蛋白质组**

研究人员鉴定出550种在衰老过程中变得不溶的蛋白，其中74%可通过ATP补充重新溶解。不溶性组分包含参与代谢调控、蛋白质折叠（如分子伴侣和热休克蛋白）及氧化还原稳态的蛋白。值得注意的是，线粒体核糖体亚基在衰老中变得更加不溶且即使添加ATP后仍保持不溶状态，电子传递链组分和线粒体代谢酶也表现出溶解度下降。此外，多种自噬/线粒体自噬调控因子、泛素和SUMO E3连接酶（如RING1、NSMCE2和RANBP2）及蛋白酶体核心颗粒亚基在不溶性蛋白质组中富集。靶向质谱分析显示，K27泛素链在不溶性组分中富集。

**细胞衰老引发区别于其他应激反应的独特应答**

研究人员将复制性衰老的蛋白质组变化与多种应激条件下的蛋白质组进行了系统比较，包括蛋白酶体抑制（Bortezomib和MG132）、自噬抑制（Bafilomycin A₁）、HSP90伴侣抑制（DMAG-17）、氧化应激（过氧化氢）、氨基酸饥饿诱导的可逆细胞周期停滞以及Inflachromene（ICM）诱导的类衰老表型。主成分分析表明，复制性衰老的蛋白质组变化与其他应激反应显著不同，蛋白质稳态网络的重塑是重要的区分因素。ICM诱导的类衰老表型仅部分模拟了复制性衰老的变化。Louvain聚类分析显示，168种蛋白的丰度变化仅在复制性衰老中发生，核糖体蛋白的耗竭仅被ICM部分模拟，而自噬蛋白水平的增加则是细胞衰老的特异性特征。

**总结与结论**

尽管细胞衰老在60多年前即被发现，但蛋白质组层面的分子机制仍不清楚。本研究系统描绘了人成纤维细胞复制性衰老过程中转录组、蛋白质组、SUMO2/3和泛素修饰蛋白质组以及蛋白质溶解度的变化。研究发现，衰老中蛋白质组重塑以协同方式发生，蛋白质耗竭是普遍特征，核蛋白和染色质相关蛋白尤其受到影响，且这种耗竭以协调有序的方式进行。蛋白质稳态网络的重塑具有强烈且独特的贡献，包括翻译机器和泛素介导的降解机器的变化，这些变化未被其他细胞应激条件所模拟。线粒体核糖体亚基以独特方式受到调控，并分选至不溶性蛋白质组。K11和K27连接的偶联泛素在衰老中积累，K27连接在不溶性组分中富集。综合而言，本研究揭示了衰老过程中细胞过程的复杂重塑，这不仅源于转录-翻译轴的功能障碍，还涉及蛋白质稳态网络的改变和染色质相关蛋白质组的耗竭。这些发现强调了未来需要在不同衰老模型中识别和定义保守机制，并为开发靶向衰老细胞的新治疗干预策略开辟了途径。