造血细胞特异性DARC缺失加剧肥胖相关脂肪组织炎症与糖耐量受损：基于DARC条件性敲除小鼠模型的研究

《Cells》：Challenges in Developing a Microglial NF-Kappa B Conditional Mouse Model for Glioblastoma Studies

　　

目的：肥胖中的脂肪组织炎症促进胰岛素抵抗和代谢性疾病。Duffy抗原趋化因子受体（DARC），一种表达于红细胞及其他细胞类型的非信号受体，通过调节趋化因子水平来调控炎症。影响红细胞上DARC表达的基因变异在非洲裔人群中较为常见。本研究在造血细胞和脂肪细胞中分别敲除DARC表达，以确定其对肥胖的影响。方法：将DARC floxed小鼠与vav1-Cre小鼠杂交，以在造血细胞中敲除DARC表达（DARCΔhemato），并与adipoq-Cre小鼠杂交，以在脂肪细胞中敲除DARC表达（DARCΔadipo）。小鼠分别饲喂普通饮食（CD）与高脂饮食（HFD），并进行体内研究。体外研究使用从野生型（WT）和DARC全身敲除小鼠中分离的前脂肪细胞开展。结果：与WT同窝小鼠相比，HFD喂养的DARCΔhemato小鼠表现出糖耐量受损，且与体重增加无关。这与脂肪组织炎症增加和系统性氧化应激增强相关。DARCΔadipo小鼠表现出与WT同窝小鼠相似的糖耐量，但脂肪库质量和脂肪细胞大小存在细微差异。在前脂肪细胞中敲除DARC对体外成脂分化或脂质积累没有影响。同样，内皮细胞特异性DARC敲除小鼠与WT小鼠相比，糖耐量也没有差异。结论：造血细胞中DARC的敲除与脂肪组织炎症相关，并在饮食诱导的肥胖过程中改变葡萄糖稳态，同时伴有几种DARC结合趋化因子循环水平的降低。这些发现与人类DARC基因变异及肥胖相关代谢性疾病的关联性有待进一步研究。

论文解读

一、研究背景与意义

肥胖以慢性低度脂肪组织炎症为特征，伴随促炎细胞因子和趋化因子产生增加。肿瘤坏死因子α（TNFα）和单核细胞趋化蛋白-1（MCP-1）等脂肪细胞因子和趋化因子已被证实与胰岛素抵抗的发生存在因果关系，而胰岛素抵抗是肥胖相关代谢性疾病和2型糖尿病的核心特征。趋化因子不仅与其相应的信号受体结合，还可与非信号受体结合，其中最值得关注的是非典型趋化因子受体1（ACKR1），即Duffy抗原趋化因子受体（DARC）。在人体中，DARC主要表达于红细胞和毛细血管或毛细血管后内皮细胞，被认为通过隔离趋化因子或调节其在炎症局部的浓度来发挥作用。DARC具有广泛的配体结合能力，可与多种C-C和C-X-C基序趋化因子结合，尤其对CCL2/MCP-1具有较强亲和力。DARC功能缺失与人类和小鼠血清中DARC结合趋化因子水平降低相关，并增强MCP-1诱导的单核细胞动员和脂多糖诱导的炎症反应。

人类DARC基因存在三种主要等位基因：FYB、FYA和FYO，其分布因地区和祖先来源而异。FYA是全球最常见的等位基因，在亚洲裔人群中最为普遍；FYB在欧洲裔人群中占主导；FYO在非洲裔人群中最为常见。FYA等位基因在功能上整体偏低，而FYO等位基因与红细胞上DARC表达的选择性缺失相关，被认为是间日疟原虫感染施加的选择压力所致。非洲裔美国人相较白种人表现出更高的炎症水平和肥胖相关代谢性疾病风险，尽管这些差异很大程度上可由饮食、运动等环境因素解释，但非肥胖非洲裔美国人的胰岛素敏感性也据报道较低，提示DARC基因型等祖先因素可能也有贡献。

研究人员此前报道，全身性敲除DARC的小鼠在高脂饮食喂养下出现脂肪组织炎症增加和胰岛素抵抗。值得注意的是，非肥胖的DARC敲除（KO）小鼠在普通饮食喂养下也表现出糖耐量受损。这提示DARC可能在非肥胖状态下、在趋化因子浓度未上调的情况下调节胰岛素诱导的葡萄糖摄取，且可能独立于其在造血来源细胞中的表达。鉴于DARC在多种细胞类型中均有表达，包括造血细胞、脂肪细胞和内皮细胞，一个重要的问题是：DARC是否通过特定的细胞 compartments 来调节肥胖相关的糖耐量受损。为此，研究人员构建了DARC-floxed小鼠，以确定造血细胞中DARC表达的敲除是否会加剧肥胖相关的代谢性疾病，同时检测了DARC在胰岛素敏感组织中的表达，并意外地在脂肪组织中检测到高水平的DARC表达，因此也进一步检验了成熟脂肪细胞中DARC表达在饮食诱导肥胖中的作用。

二、主要技术方法

研究人员构建了DARC floxed小鼠（将loxP位点置于DARC启动子区和外显子2两侧），分别与Vav-1-Cre小鼠、脂联素-Cre（adipoq-Cre）小鼠和VE-钙黏蛋白-Cre（VE-Cadherin-Cre）小鼠杂交，获得造血细胞特异性（DARC^Δhemato）、脂肪细胞特异性（DARC^Δadipo）和内皮细胞特异性（DARC^ΔEC）DARC敲除小鼠，均基于C57BL/6背景，购自Jackson Laboratories。8周龄雄性小鼠维持普通饮食（CD）或转为高脂饮食（HFD，60%热量来自脂肪）最长40周。主要技术手段包括：核磁共振（NMR）波谱法测量体成分；腹腔注射葡萄糖耐量试验（GTT）和胰岛素耐量试验（ITT）；酶联免疫吸附测定（ELISA）检测血浆MCP-1、IL-6、TNFα、胰岛素、8-异前列腺素、4-羟基壬烯醛（HNE）和天冬氨酸氨基转移酶（AST）；SYBR Green定量RT-PCR检测组织mRNA表达；Western blot检测MCP-1和Akt磷酸化；从WT和全身DARC KO小鼠分离皮下和内脏前脂肪细胞进行原代培养和成脂分化；葡萄糖摄取-Glo检测法测定胰岛素刺激的葡萄糖摄取；组织学H&E染色、油红O（ORO）染色及F4/80免疫组化评估肝脏脂肪变性和脂肪组织巨噬细胞浸润；Luminex多因子检测平台进行血浆细胞因子谱分析；流式细胞术检测外周血单核细胞、中性粒细胞、树突状细胞和自然杀伤（NK）细胞频率。

三、研究结果

3.1 造血细胞特异性DARC敲除在高脂饮食期间改变糖耐量但不影响体重增加

研究人员将Vav1-Cre小鼠与DARC floxed小鼠杂交，生成造血细胞特异性DARC敲除（DARC^Δhemato）小鼠。验证结果显示DARC mRNA在骨髓和脾脏中显著降低，但在脂肪组织和脑中无变化。DARC^Δhemato和WT小鼠在高脂饮食下体重增加相当。HFD喂养的DARC^Δhemato小鼠在葡萄糖注射后60分钟和90分钟时间点血糖显著高于WT小鼠，GTT曲线下面积（AUC）显著增加。胰岛素注射后90分钟时间点血糖也显著升高，但ITT衍生的KITT无显著差异。血浆胰岛素水平无差异。DARC^Δhemato小鼠在高脂饮食下出现更明显的肝脏增大和脂肪变性。此外，DARC^Δhemato小鼠循环白细胞（包括单核细胞和中性粒细胞）呈增加趋势，炎症细胞因子（如干扰素和TNFα）水平升高，而DARC结合趋化因子（包括CCL2、CCL5、CCL11和CXCL1）的血浆水平显著降低。

3.2 HFD喂养的DARC^Δhemato小鼠脂肪组织炎症增加

HFD喂养的DARC^Δhemato小鼠内脏脂肪中MCP-1蛋白水平高于WT小鼠，Mcp-1、Il-6、Tnfα以及CCL5和CXCL1的mRNA水平均升高。F4/80阳性巨噬细胞免疫染色显示，HFD喂养的DARC^Δhemato小鼠内脏脂肪中冠样结构显著增多。巨噬细胞相关基因表达变化包括Nox2和Ptgs2升高、Arg1和Retnla降低。血浆8-异前列腺素和HNE水平在HFD喂养的DARC^Δhemato小鼠中显著升高，表明氧化应激增强。两组间脂肪细胞数量和大小无差异，脂肪组织中DARC表达也无差异。

3.3 DARC表达缺失对成脂分化和葡萄糖摄取无影响

DARC mRNA在骨髓中高表达，脾脏中次之，在皮下和内脏脂肪组织中也有显著表达。CD喂养的全身DARC KO小鼠皮下脂肪细胞显著增大，内脏脂肪细胞有增大趋势；HFD喂养下，全身DARC基因敲除导致内脏脂肪细胞增大，而皮下脂肪细胞大小相似。体外实验中，从WT和DARC KO小鼠分离的前脂肪细胞在成脂分化过程中，Pparγ、Fabp4、脂联素和C/EBPα在第14天较第0天显著升高，但WT和DARC KO细胞之间无差异。ORO染色显示脂质积累在两组间也无差异。胰岛素刺激的葡萄糖摄取和Akt磷酸化在WT与DARC KO来源的分化脂肪细胞之间相似。

3.4 脂肪细胞特异性DARC敲除与HFD喂养期间糖耐量受损无关

研究人员将DARC floxed小鼠与adipoq-Cre小鼠杂交，生成脂肪细胞特异性DARC敲除（DARC^Δadipo）小鼠。免疫组化验证确认脂肪组织中DARC被有效敲除。CD喂养的DARC^Δadipo小鼠皮下脂肪细胞较WT增大，但内脏脂肪细胞大小无显著差异。DARC^Δadipo小鼠在CD下脂肪质量显著增加、瘦体重减少，但这些差异在HFD喂养后被消除。GTT和ITT显示HFD喂养损害糖耐量，但WT和DARC^Δadipo小鼠之间无差异。

3.5 内皮细胞特异性DARC敲除不影响体重或糖耐量

研究人员将DARC floxed小鼠与VE-Cadherin-Cre小鼠杂交，生成内皮细胞特异性DARC敲除（DARC^ΔEC）小鼠。HFD喂养的DARC^ΔEC小鼠与WT对照相比，体重和糖耐量均无显著差异。

四、讨论与结论总结

讨论部分指出，造血细胞特异性DARC敲除再现了全身DARC KO小鼠的多个关键发现，包括脂肪组织炎症增加和循环趋化因子水平改变。循环中DARC结合趋化因子减少与脂肪组织中炎症趋化因子积累并存，与DARC在肥胖期间调节趋化因子分布的作用一致。然而，研究并未确立红细胞趋化因子缓冲或转运功能受损与脂肪组织炎症增加或代谢异常之间的因果关系。脂肪细胞特异性DARC敲除小鼠在基础状态下表现出皮下脂肪细胞肥大和脂肪量增加，但在HFD喂养下不影响体重增加、肥胖程度或糖耐量，提示脂肪细胞中DARC表达可能调节体内脂肪细胞形态的某些方面，但未产生可检测的代谢异常。

研究存在以下局限性：人类非洲裔人群常见的DARC基因变异导致的是红细胞选择性DARC表达缺失，而非所有造血细胞，目前缺乏可选择性敲除红细胞中基因的Cre驱动小鼠；DARC在骨髓巨噬细胞和单核细胞亚群中也有表达，其在免疫细胞中的作用可能超出红细胞；所有小鼠维持在环境温度而非热中性条件下，可能减弱了肝脏重量和脂肪细胞大小的变化；GTT和ITT在造血细胞和脂肪细胞特异性KO小鼠中于不同时间点进行，限制了两组间的直接比较；未进行代谢笼分析；未纳入雌性小鼠；部分机制分析样本量较小（n=3），统计效力有限。

研究结论：造血细胞中DARC的敲除与循环趋化因子水平改变、肥胖期间脂肪组织炎症和氧化应激增加以及饮食诱导肥胖期间葡萄糖稳态受损相关。鉴于所用造血细胞特异性小鼠模型与人类基因变异相关的红细胞选择性DARC缺陷之间存在差异，这些发现与人类DARC变异和代谢性疾病的相关性有待进一步研究。