菌株依赖性发酵增强龙须菜多糖富集组分的生物活性

《Foods》：Strain-Dependent Fermentation Enhances the Bioactivity of Gracilariopsis lemaneiformis Polysaccharide-Rich Fractions

　　

摘要 乳酸菌发酵为调控海藻来源碳水化合物组分并强化其功能特性提供了一种温和策略。本研究从未发酵的龙须菜（Gracilariopsis lemaneiformis）以及经两株海洋来源乳酸菌——干酪乳杆菌（Lacticaseibacillus casei）DS31和植物乳杆菌（Lactiplantibacillus plantarum）HJ-S2发酵的生物质中回收了多糖富集组分（分别命名为GP、GP-D和GP-H）。发酵改变了总碳水化合物和硫酸化碳水化合物的回收率，并改变了单糖组成谱。在野生型N2线虫中，GP、GP-D和GP-H分别将平均寿命延长了8.61%、14.70%和21.21%，并改善了热应激和氧化应激存活率（GP-H组中位生存时间分别增加44%和20%）、运动能力、氧化还原稳态（GP-H组SOD活性+19.5%，MDA含量?73.4%）以及蛋白质稳态相关表型。启动子-报告基因检测、DAF-16::GFP定位和转录组学分析鉴定出不同的处理相关应激反应程序。寿命延长效应在daf-16功能缺失突变体背景下依然持续存在，支持互补性长寿网络的贡献。综上，菌株依赖性发酵重塑了龙须菜多糖富集组分并增强了其体内生物活性，其中GP-H在测定的寿命和健康寿命终点中产生了最广泛的改善效果。

一、研究背景与科学问题

人口老龄化加剧了对能够维持生理功能和应激弹性的膳食策略的探索。衰老反映了氧化还原平衡、蛋白质稳态、线粒体性能和细胞维持机制之间的相互作用，而非单一通路的失效。秀丽隐杆线虫（Caenorhabditis elegans）因其可在单一模型内同时评估寿命、应激存活、运动、生殖、蛋白聚集以及保守的调控反应，成为筛选食源性生物活性物质的理想体系。天然多糖因其组成和高级结构可通过食品加工进行调控，并与抗氧化、代谢和细胞保护功能相关联，成为该领域的重点研究对象。

龙须菜（Gracilariopsis lemaneiformis）是一种具有重要经济价值的红藻，富含琼脂型和硫酸化半乳聚糖多糖。已有研究表明龙须菜多糖具有抗氧化活性，并在线虫中与寿命延长、多聚谷氨酰胺聚集减少及DAF-16核转位相关。然而，天然海藻多糖的功能性能受限于致密的细胞壁组织、有限的提取率以及异质的分子结构。乳酸菌发酵可通过酸化、底物特异性酶促反应和微生物代谢改变多糖架构，是一种食品兼容的加工策略。由于这些效应同时取决于底物和微生物菌株，两株乳酸菌应用于同一藻类生物质可能产生化学和功能上截然不同的组分，而非等效产物。

目前尚缺乏将菌株特异性重塑龙须菜碳水化合物组分与寿命、健康寿命、蛋白质稳态及宿主基因表达反应相联系的系统研究。本研究旨在填补这一空白，明确发酵是仅仅增加了总碳水化合物的回收率，还是生成了具有不同生物反应谱的功能性差异制剂。

二、研究内容与主要发现

研究人员采用海洋来源的植物乳杆菌HJ-S2和干酪乳杆菌DS31对龙须菜生物质进行发酵，回收了未发酵组分（GP）和两种发酵后组分（GP-D和GP-H），系统比较了其碳水化合物组成和结构特征，并在线虫模型中评估了其对寿命、热应激和氧化应激存活、运动能力、生殖、抗氧化状态、多聚谷氨酰胺聚集、应激反应报告基因、DAF-16定位及转录组谱的影响。

研究发现，发酵以菌株依赖性方式改变了碳水化合物的回收率和组成。GP-D的硫酸基含量最高（0.91%），为GP的2.76倍；GP-H的总碳水化合物含量最高（11.78%），相对GP增加39.4%。单糖组成分析显示，两种发酵均增加了葡萄糖和葡萄糖醛酸的比例，降低了半乳糖比例，但两菌株对鼠李糖的影响方向相反。FT-IR光谱证实了核心琼脂结构的保留，但硫酸基相关谱带强度存在菌株依赖性差异。在功能层面，GP-H在寿命延长（+21.21%）、热应激和氧化应激存活、运动能力、SOD活性提升（+19.5%）、MDA含量降低（?73.4%）及多聚谷氨酰胺聚集减少方面表现最优。GP-D也显著延长了寿命（+14.70%），并表现出突出的热应激和蛋白质稳态改善效应。在daf-16突变体中，GP-D和GP-H仍能显著延长寿命，表明存在DAF-16之外的互补长寿通路。转录组分析显示，GP-H以daf-16、skn-1、jnk-1和p38/p38 MAPK相关转录本升高为特征，GP-D则以hsp-16家族、sod-3和mtl-1表达增强为特征，GP则富集于sir-2.1、自噬和线粒体功能相关转录本。

三、关键技术方法

研究人员采用了以下关键技术方法：从海洋动物肠道分离并鉴定两株乳酸菌（干酪乳杆菌DS31分离自大黄鱼肠道，植物乳杆菌HJ-S2分离自拜氏喙鲸肠道）；乙醇沉淀结合三氯乙酸除蛋白的多糖富集工艺；苯酚-硫酸法测定总碳水化合物含量；BaCl₂-明胶浊度法测定硫酸基含量；PMP柱前衍生化结合高效液相色谱分析单糖组成；傅里叶变换红外光谱表征结构特征；线虫寿命、应激存活、运动、生殖、抗氧化酶活性、多聚谷氨酰胺聚集、DAF-16::GFP定位、报告基因荧光定量等表型分析；以及基于Illumina平台的转录组测序和生物信息学分析。

四、研究结果

4.1 发酵行为与回收组分组成

发酵过程中OD₆₀₀升高、pH和还原糖浓度下降，表明细菌生长和碳水化合物消耗。12-24小时还原糖浓度短暂回升，可能反映了海藻基质中还原端或可溶性糖的释放速率暂时超过微生物摄取速率。发酵改变了乙醇可沉淀碳水化合物的回收量，GP-D和GP-H的总碳水化合物分别较GP增加20.4%和39.4%，硫酸基含量分别增加2.76倍和1.88倍。FT-IR光谱显示核心半乳聚糖框架得以保留，但硫酸基相关谱带强度存在菌株依赖性差异。

4.2 单糖组成

GP以葡萄糖（53.93%）和半乳糖（32.47%）为主。DS31发酵使葡萄糖增加10.42个百分点、葡萄糖醛酸增加0.87个百分点，半乳糖和鼠李糖分别减少6.32和4.62个百分点。HJ-S2发酵使葡萄糖增加8.09个百分点、葡萄糖醛酸增加2.24个百分点、鼠李糖增加1.23个百分点，半乳糖减少9.19个百分点。两菌株产生了不同的化学重塑结果。

4.3 寿命与应激存活

与未处理对照相比，GP、GP-D和GP-H分别将平均寿命延长8.61%、14.70%和21.21%。GP-H是唯一在野生型寿命曲线和两种急性应激曲线中均产生显著改善的组分。在daf-16(mu86)突变体中，三种组分仍分别延长寿命10.07%、15.44%和39.52%，表明DAF-16相关调控与互补长寿通路协同作用。

4.4 运动、生殖与抗氧化状态

GP-H在第10天增加身体弯曲频率，并在第8天和第10天增加头部摆动频率；GP-D在第10天增加头部摆动频率。总产卵量在各组间无显著差异，表明寿命和运动表型的改善未伴随生殖-存活权衡。SOD活性在GP、GP-H和GP-D组分别增加8.41%、19.52%和11.44%，MDA含量分别降低50.77%、73.36%和63.73%。

4.5 蛋白质稳态与应激反应报告基因

三种组分均减少了AM141线虫中Q40::YFP聚集负担，增加了sod-3和gst-4启动子驱动的荧光强度，并提高了TJ356线虫中DAF-16::GFP核定位比例。报告基因和突变体结果共同支持DAF-16相关调控与SKN-1等平行细胞保护程序的网络化参与。

4.6 转录组分析

12个文库的clean reads为36.08-42.01百万条，Q30值96.63%-96.83%。PCA分析清晰分离了四个处理组，组内Pearson相关系数为0.988-0.992。热图显示GP-H以daf-16、skn-1、jnk-1和p38/p38 MAPK相关转录本升高为特征，GP-D以hsp-16家族、sod-3和mtl-1表达增强为特征，GP则富集于sir-2.1、自噬和线粒体功能相关转录本。

4.7 长寿与应激相关基因表达模式

16个基因的表达谱显示，GP-D和GP-H显著增加daf-16表达，skn-1相对稳定。三种组分均增加gst-4和sod-3表达，发酵组分反应最强。GP-D产生最高的hsp-16.48和hsp-16相关表达，GP-H和GP在JNK/p38相关、金属硫蛋白和去乙酰化酶相关基因中产生较强反应。自噬相关基因bec-1和lgg-1在各处理组均升高，clk-1被三种组分均上调，mev-1呈现独特的发酵依赖性模式。

五、讨论总结与结论

研究表明，发酵以菌株依赖性方式改变了龙须菜多糖富集组分的化学特征和生物学性能。GP-D具有最高的硫酸基含量，GP-H则兼具最高的总碳水化合物含量和最广泛的寿命、应激抗性、运动、氧化还原状态和蛋白质稳态改善效应。这种非平行排序表明功能性能无法从单一组成变量预测。植物乳杆菌HJ-S2具有广泛的碳水化合物利用能力和丰富的碳水化合物活性酶谱，可能促进了更广泛的海藻碳水化合物底物重塑；干酪乳杆菌DS31的蛋白水解和酸化特性可能有利于硫酸基相关组分的释放或富集。两菌株均分离自海洋动物肠道，其海洋来源可能有助于适应复杂的海洋碳水化合物环境。

DAF-16是重要的调控节点，但突变体和表达数据表明存在更广泛的网络参与。GP-D优先增加hsp-16家族表达和多种氧化还原防御基因，与其突出的急性应激和蛋白质稳态表型一致；GP-H结合daf-16诱导与JNK/p38相关、金属硫蛋白、自噬和线粒体功能基因的显著变化，与其更广泛的生理表现一致。研究将菌株特异性发酵化学、全生物体寿命和健康寿命结果以及协调的分子反应三个层面的证据联系起来，确立了起始菌株选择作为调控海藻来源碳水化合物成分生物学性能的实用途径，为健康老龄化导向的功能食品开发提供了工艺层面的原理和生物体层面的基准。