《International Journal of Molecular Sciences》：Zeb1 Is a Determinant of EMT in Human MDA-MB-231 Breast Cancer Cells and M13-MDA231 Tumor Hybrids
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Zeb1是一种公认的上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）转录因子，在侵袭性癌症中高表达。肿瘤杂交细胞（tumor hybrids）源于癌细胞与正常细胞（如巨噬细胞和干细胞）之间的融合事件，可
摘要专业翻译
Zeb1是一种公认的上皮-间质转化（epithelial–mesenchymal transition，EMT）转录因子，在侵袭性癌症中高表达。肿瘤杂交细胞（tumor hybrids）源于癌细胞与正常细胞（如巨噬细胞和干细胞）之间的融合事件，可具有增强的转移活性等新特性。本研究在M13-MDA231-6和-13肿瘤杂交细胞中研究了Zeb1的作用，这两种杂交细胞源于MDA-MB-231-Hyg人乳腺癌细胞与M13SV1-EGFP-Neo人乳腺上皮细胞之间的自发融合事件。稳定的CRISPR/Cas9介导的Zeb1敲除（Zeb1-KO）与MDA-MB-231-Hyg-Zeb1-KO和M13-MDA231-13-Zeb1-KO细胞中E-钙黏蛋白（E-Cadherin）的重新表达相关，但在M13-MDA231-6-Zeb1-KO细胞中则不然。同样，与未编辑细胞相比，MDA-MB-231-Hyg-Zeb1-KO和M13-MDA231-13-Zeb1-KO细胞的增殖能力下降，而M13-MDA231-6-Zeb1-KO细胞则不然。在跨膜迁移和侵袭研究中，Zeb1-KO细胞的迁移活性较未编辑细胞显著降低。然而，MDA-MB-231-Hyg-Zeb1-KO细胞和M13-MDA231-6-Zeb1-KO肿瘤细胞仅在划痕/伤口愈合实验中表现出降低的迁移行为，而M13-MDA231-13-Zeb1-KO则表现出增强的运动活性。相比之下，Zeb1敲除对集落形成能力或CD44+/CD104+表达未观察到明确影响。总之，研究数据支持Zeb1作为EMT和癌细胞迁移驱动因子的作用。
论文解读
一、研究背景与意义
上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）被认为是癌症转移的起始步骤，是一个高度复杂且协调的过程，癌细胞在此过程中逐步丧失上皮特征（如E-钙黏蛋白介导的细胞间接触），同时获得更具间质样的表型。EMT过程由所谓的核心EMT调控网络控制，该网络由EMT转录因子、微小RNA（microRNA，miRNA）、翻译后修饰和选择性剪接的相互作用组成。其中，两个微小RNA（miR-34a-5p和miR-200c-3p）与两个EMT转录因子（Snail和Zeb1）形成两个相互连接的互抑制反馈环路（miR-34a-5p-Snail和miR-200c-3p-Zeb1），决定癌细胞维持在上皮（E）、间质（M）或混合上皮/间质（E/M）状态。值得注意的是，这种混合E/M状态并非EMT过程中的中间过渡态，而是癌细胞可以采用的稳定表型，且具有混合E/M表型的癌细胞表现出潜在的肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）特性。
Zeb1作为公认的EMT驱动因子，通过下调经典上皮标志物E-钙黏蛋白发挥作用。Zeb1在多种人类癌症中高表达，包括结肠癌、胶质母细胞瘤和乳腺癌，且其高表达与疾病预后不良、转移扩散增加相关。细胞融合是癌细胞与正常细胞（如巨噬细胞和干细胞）合并形成肿瘤杂交细胞的过程，这些杂交细胞常具有增强的转移行为等新特性。此前研究已表明，在HS578T乳腺癌细胞来源的M13HS肿瘤杂交细胞中，Zeb1敲除与差异性迁移表型相关，但未伴随E-钙黏蛋白的重新表达。基于此，本研究旨在探讨Zeb1敲除对MDA-MB-231-Hyg乳腺癌细胞及其来源的M13-MDA231肿瘤杂交细胞的影响，以进一步阐明Zeb1在EMT和癌细胞迁移中的作用。
二、主要技术方法
研究人员采用了以下关键技术方法开展研究：利用CRISPR/Cas9基因编辑技术对MDA-MB-231-Hyg乳腺癌细胞及M13-MDA231-6和-13肿瘤杂交细胞进行稳定的Zeb1基因敲除，并通过Sanger测序和Western blot验证编辑效果；采用Western blot分析上皮标志物（E-钙黏蛋白、细胞角蛋白5）、间质标志物（N-钙黏蛋白、波形蛋白）及Snail的表达水平；通过CCK8增殖实验检测细胞增殖速率；通过集落形成实验评估细胞集落形成能力；采用Transwell/Boyden小室实验检测细胞跨膜迁移能力，采用Geltrex基质包被的Transwell小室进行侵袭实验；通过划痕/伤口愈合实验评估细胞运动能力；利用流式细胞术检测CD44/CD104表达模式；通过实时荧光定量PCR（qPCR）检测miR-200c-3p和miR-34a-5p的表达水平；采用共聚焦激光扫描显微镜观察细胞形态变化。所有细胞系均来源于此前已建立并验证的细胞模型。
三、研究结果
2.1 成功实现CRISPR/Cas9介导的Zeb1敲除
研究人员通过CRISPR/Cas9基因编辑在MDA-MB-231-Hyg乳腺癌细胞和M13-MDA231杂交细胞中实现了稳定的Zeb1敲除，Sanger测序和Western blot结果证实了不同传代和克隆中Zeb1基因的成功编辑。
2.2 E-钙黏蛋白在MDA-MB-231-Hyg-Zeb1-KO和M13-MDA231-13-Zeb1-KO细胞中重新表达
Western blot结果显示，Zeb1敲除对上皮和间质基因表达模式的总体影响较为温和。值得注意的是，E-钙黏蛋白在MDA-MB-231-Hyg-Zeb1-KO细胞和M13-MDA231-13-Zeb1-KO杂交细胞中重新表达，但在M13-MDA231-6-Zeb1-KO杂交细胞中未观察到。Zeb1敲除与两个杂交克隆中N-钙黏蛋白表达略有升高相关，尽管其Snail表达水平显著降低。MDA-MB-231-Hyg细胞中Zeb1敲除与Snail表达升高相关。波形蛋白表达水平在Zeb1敲除细胞中保持不变。
2.3 Zeb1敲除对细胞增殖速率产生差异性影响
CCK8增殖实验表明，MDA-MB-231-Hyg-Zeb1-KO细胞和M13-MDA231-13-Zeb1-KO杂交细胞的增殖速率显著低于其亲本细胞，而M13-MDA231-6-Zeb1-KO杂交细胞的增殖速率则显著高于其亲本细胞。
2.4 Zeb1敲除对细胞集落形成能力产生差异性影响
集落形成实验显示，MDA-MB-231-Hyg-Zeb1-KO细胞的集落形成能力较未编辑细胞降低但未达显著水平；M13-MDA231-6-Zeb1-KO杂交细胞的集落形成能力显著高于亲本细胞；而M13-MDA231-13杂交细胞与其Zeb1敲除变体的集落形成能力相似。
2.5 Zeb1敲除细胞在Transwell/Boyden小室实验中迁移活性显著降低
Transwell迁移实验（数据已按增殖速率归一化）显示，Zeb1敲除细胞的迁移活性低于未编辑细胞，其中M13-MDA231-6-Zeb1-KO细胞的迁移活性几乎完全被消除，而MDA-MB-231-Hyg-Zeb1-KO细胞的迁移活性较亲本细胞中度降低。
2.6 Zeb1敲除细胞侵袭能力显著降低
侵袭实验（数据已按增殖速率归一化）表明，所有Zeb1敲除细胞的侵袭能力均显著降低，其中M13-MDA231杂交细胞的降低幅度更为显著，而MDA-MB-231-Hyg-Zeb1-KO细胞的侵袭能力降低幅度较小。
2.7 划痕/伤口愈合实验显示Zeb1敲除细胞具有不同的迁移特性
划痕实验（伤口面积已按增殖速率归一化）结果与Transwell实验结果部分一致：MDA-MB-231-Hyg-Zeb1-KO和M13-MDA231-6-Zeb1-KO细胞的迁移活性显著降低，但M13-MDA231-13-Zeb1-KO细胞表现出增强的运动活性，其伤口面积小于未编辑的M13-MDA231-13肿瘤杂交细胞。
2.8 Zeb1敲除细胞较未编辑亲本细胞具有更低的miR-200c-3p水平
qPCR结果显示，未编辑细胞的miR-200c-3p表达与Zeb1蛋白表达吻合良好：M13SV1-EGFP-Neo细胞因上皮表型和缺乏Zeb1表达而具有高水平的miR-200c-3p，而MDA-MB-231-Hyg细胞和两个M13-MDA231杂交细胞均表达Zeb1但几乎缺乏miR-200c-3p。然而，Zeb1敲除细胞的miR-200c-3p表达水平甚至低于其未编辑对应细胞，这一发现与miR-200c-3p-Zeb1负反馈环路的预期不符。miR-34a-5p的表达数据与细胞的Snail表达水平不完全匹配。
2.9 Zeb1敲除对CD44/CD104表达模式的影响
流式细胞术结果显示，MDA-MB-231-Hyg-Zeb1-KO和M13-MDA231-6-Zeb1-KO细胞中CD44+/CD104+细胞比例增加，而M13-MDA231-13-Zeb1-KO杂交细胞中CD44+/CD104+细胞比例显著降低，但所有差异均未达到统计学显著水平。
2.10 Zeb1敲除改变MDA-MB-231-Hyg细胞形态但未改变M13-MDA231杂交克隆形态
共聚焦显微镜观察显示，MDA-MB-231-Hyg-Zeb1-KO细胞较未编辑细胞更大且更趋于圆形，部分细胞仍呈现间质样表型。而M13-MDA231杂交克隆本身呈圆形、上皮样形态，其Zeb1敲除变体的形态与未编辑对应细胞相比未发生改变。
四、讨论与结论
讨论部分指出，M13SV1-EGFP-Neo细胞呈现经典上皮状态，表达E-钙黏蛋白和细胞角蛋白5，同时也表达Snail，这一发现可能归因于细胞系特异性特征。MDA-MB-231-Hyg细胞和M13-MDA231肿瘤杂交细胞呈现更间质样表型，表达Zeb1和波形蛋白，但MDA-MB-231-Hyg细胞不表达N-钙黏蛋白，这与文献中关于MDA-MB-231细胞N-钙黏蛋白表达的不同报道一致。Zeb1敲除在MDA-MB-231-Hyg细胞中重新诱导E-钙黏蛋白表达与已发表数据一致，但波形蛋白表达未降低。Zeb1敲除对细胞增殖和集落形成的影响在M13-MDA231杂交克隆中与Zeb1促进增殖的已知作用相悖，研究人员推测这可能与杂交细胞系特异性差异有关。跨膜迁移和侵袭实验结果表明Zeb1敲除显著降低细胞的迁移和侵袭能力，支持Zeb1在EMT和促进更运动、更侵袭表型中的作用。划痕实验中M13-MDA231-13-Zeb1-KO细胞表现出的增强运动活性可能与Transwell实验和划痕实验的读数差异有关。miR-200c-3p数据与预期不符，提示其他miR-200家族成员可能参与调控Zeb1表达。
研究结论部分指出，研究数据表明Zeb1与MDA-MB-231-Hyg和M13-MDA231肿瘤杂交细胞的EMT相关。事实上，Zeb1敲除细胞的迁移和侵袭特性均减弱，而增殖、集落形成和CD44/CD104表达的数据则较为不一致。单个M13-MDA231肿瘤杂交克隆及其Zeb1敲除变体在增殖、CD44/CD104表达和集落形成等方面表现出不同特征，其原因很可能归因于与细胞融合相关的多种基因组改变。值得注意的是，肿瘤杂交细胞在经历促进肿瘤细胞异质性的过程后仍能维持某些特征（如Zeb1参与EMT），这一发现具有重要意义。研究数据还表明，所使用的乳腺癌细胞模型可能起重要作用：MDA-MB-231细胞中Zeb1敲除与E-钙黏蛋白重新表达相关，而HS578T细胞中Zeb1敲除则未伴随E-钙黏蛋白重新表达，提示乳腺癌细胞系特异性差异在乳腺癌和EMT研究中需要加以考虑。
