《International Journal of Molecular Sciences》：Modeling Diabetic Neuropathy: Injury Biomarkers for Early Detection Through Neuronal and Glial In Vitro Models
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糖尿病（DM）是一种快速增长的全球健康负担，也是慢性并发症的主要原因。其中，糖尿病周围神经病变（DN）是最常见和致残性最强的并发症之一，影响高达一半的长期糖尿病患者，并同时累及躯体性及自主性神经纤维。DN以隐匿性起病为特征：轴突和胶质损伤在亚临床阶段即已开始，
糖尿病（DM）是一种快速增长的全球健康负担，也是慢性并发症的主要原因。其中，糖尿病周围神经病变（DN）是最常见和致残性最强的并发症之一，影响高达一半的长期糖尿病患者，并同时累及躯体性及自主性神经纤维。DN以隐匿性起病为特征：轴突和胶质损伤在亚临床阶段即已开始，且常仅在不可逆损伤发生之后才被检出，因为常规神经系统检查和神经传导研究对早期病变检测的敏感性不足。DN的发病机制是多因素的，主要由慢性高血糖驱动，而慢性高血糖触发了一系列汇合的致病机制。本叙述性综述旨在探讨DN不断演变的疾病图景，特别关注神经损伤生物标志物在糖尿病神经损伤早期检测中的研究。此外，本综述强调了体外神经元和胶质模型作为互补实验平台的相关性，以研究DN的分子和细胞机制，并支持候选生物标志物的鉴定和验证。更重要的是，这些体外系统为检查循环因素对轴突和胶质完整性的影响提供了战略性工具，从而促进潜在血液生物标志物的发现和初步评估。
1. 引言
糖尿病周围神经病变（DN）是一种慢性、长度依赖性轴索性病变，以感觉、运动和自主神经纤维的进行性退变为特征。纤维变性通常始于最长的外周轴突，先影响小直径无髓C纤维和薄髓Aδ纤维，随后扩展至负责本体感觉和运动功能的大髓纤维。DN的标志性特征是其漫长的亚临床期：轴突变性、施万细胞（SC）功能障碍、脱髓鞘、微血管损伤以及神经营养支持丧失均在明显神经症状出现之前已发生，导致结构和功能逐渐下降，常直至不可逆损伤时才被发现。尽管远端感觉运动性多发性神经病是最常见的临床表现，糖尿病神经退行性变不仅局限于躯体神经，也累及自主神经部分。自主神经病变呈长度依赖性进展，优先影响迷走神经等最长纤维，进而累及心血管、胃肠、泌尿生殖、泌汗和眼部的交感及副交感神经支配。自主神经病变可导致致命并发症，其中心脏自主神经病变（CAN）与心源性猝死风险增加相关。因此，DN应被视为一种多方面的神经退行性疾病，共同分子机制驱动躯体及自主神经通路的进行性神经退变。
2. 数据来源
文献检索采用叙述性方法，聚焦于研究糖尿病神经病变的分子机制、生物标志物和实验模型。检索在PubMed、Embase、Scopus、Web of Science和Google Scholar中进行，检索词组合包括“diabetic neuropathy”或“diabetic peripheral neuropathy”与“biomarker”、“neurofilament”、“GFAP”、“RAGE”、“Schwann cell”、“dorsal root ganglion”、“in vitro”、“organoid”、“microfluidic”、“high glucose”和“hypoxia”，覆盖自建库至2026年6月的文献。选择是有目的且概念驱动的，未进行正式的偏倚风险评估或定量综合分析。
3. DN的分子机制
DN的病理生理是多因素的，涉及代谢紊乱、氧化应激、血管功能障碍、慢性炎症和神经修复机制受损之间的复杂相互作用。神经元和胶质区室是主要受累对象。慢性高血糖是核心驱动因素，引发一系列相互关联的损伤通路。
3.1 神经元
慢性高血糖驱动神经元损伤，最早启动的通路之一是多元醇通路，通过醛糖还原酶将过量葡萄糖转化为山梨醇。山梨醇累积导致水内流和细胞肿胀，同时消耗NADPH，削弱谷胱甘肽再生，增加氧化应激。高血糖还促进晚期糖基化终末产物（AGEs）形成，其与神经元和内皮细胞上的受体（RAGE）结合，激活促氧化和促炎信号级联。RAGE存在膜结合型与可溶性形式（如esRAGE），两者平衡可影响AGE–RAGE信号强度。此外，线粒体功能障碍导致ATP产生受损和活性氧（ROS）生成增加，细胞色素c释放激活caspase依赖性凋亡。小直径无髓C纤维和薄髓Aδ纤维尤其脆弱，导致早期感觉缺陷和神经病理性疼痛。
3.2 施万细胞
施万细胞（SC）对周围神经髓鞘形成、轴突维持和损伤后修复至关重要。在糖尿病状态下，SC中多元醇通路上调，醛糖还原酶消耗NADPH并加剧氧化应激；线粒体功能障碍产生过量ROS并触发细胞色素c释放；AGE–RAGE信号进一步提升ROS和炎症级联。慢性PKC、NF-κB和TLR4通路激活维持TNF-α、IL-1β和IL-6的产生，驱动脱髓鞘和向未成熟修复表型转变，表现为P75增加、MAG/MBP/P0表达下降。此外，mTORC1信号失调促进SC去分化并损害髓鞘再生。这些通路共同侵蚀SC的髓鞘维持、轴突支持和再生能力，凸显其在DN中的核心作用。
3.3 血管和结缔组织成分
血管功能障碍加剧DN。高血糖损伤毛细血管，引起糖尿病微血管病变。内皮细胞中内皮型一氧化氮合酶（eNOS）活性受损，导致一氧化氮产生减少和血管收缩；内皮素-1水平升高进一步限制血流。毛细血管基底膜增厚减少氧扩散，导致神经缺血和缺氧。血管内皮生长因子（VEGF）失调造成异常血管形成和修复受损。神经炎症通过NF-κB通路激活，促进TNF-α、IL-1β和IL-6表达，并激活常驻巨噬细胞，导致慢性炎症和脱髓鞘。Toll样受体4（TLR4）在SC和免疫细胞中上调，IκBα降解使NF-κB持续活化。结缔组织如神经外膜和神经束膜发生纤维化和胶原沉积，增加机械刚度，降低神经弹性。
4. 神经元损伤的早期检测生物标志物
DN的早期检测仍是未满足的关键需求，因为当神经元丢失和轴突变性临床明显时，损伤往往已不可逆。传统检查和神经传导研究对亚临床疾病敏感性不足，促使研究转向血液生物标志物。体外模型可将候选生物标志物从机制观察推进至功能评估，帮助确定细胞来源和时间动态，并连接至可测量的轴突或胶质表型，最终测试信号是否可被调节。这些生物标志物应视为有机制支持、需后续分析验证、生物学验证和临床验证的候选物，而非已确立的诊断标志物。
4.1 表皮内神经纤维密度（IENFD）相关生物标志物
IENFD是皮肤活检中测量表皮小神经纤维数量的测试，在DN患者中可见近端至远端纤维密度下降和远端显著丢失。降钙素基因相关肽（CGRP）和P物质（SP）由伤害性C纤维释放，纤维退化时其合成和释放能力下降。血清CGRP水平未见临床证据改变；糖尿病神经病变患者血清SP水平降低，且与角膜变化相关。1型糖尿病（T1DM）伴周围神经病变患者的泪膜分析显示SP浓度下降，与角膜改变相关。
4.2 结构蛋白
神经丝轻链（NfL）是轴突骨架的重要结构蛋白，轴突损伤时释放入血，导致血清水平升高。实验动物模型显示轴突病变与血清NfL相关，早期T1DM和T2DM患者中可见DN患病。血清NfL水平与肾损伤和血糖控制不良相关，但无预测疼痛严重程度的功能。外周蛋白（PRPH）是III类中间丝蛋白，主要在外周神经系统表达，与神经突生长和轴突运输有关。链脲佐菌素诱导的1型糖尿病大鼠中，交感轴突PRPH蛋白增加；T2DM小鼠模型中，腰背根神经节（DRG）中PRPH+小直径神经元比例上升。临床队列中，吉兰–巴雷综合征（GBS）患者峰值PRPH浓度显著高于其他组。胶质纤维酸性蛋白（GFAP）在非髓鞘施万细胞中富集，其上调反映胶质激活；动物模型中卫星胶质细胞GFAP升高，但DN患者血清GFAP浓度反而降低，可能因慢性期胶质更新减少。成纤维细胞生长因子受体3（FGFR3）抗体可作为免疫介导感觉神经病亚型的候选生物标志物。
4.3 神经营养因子
糖尿病降低了神经生长因子（NGF）和脑源性神经营养因子（BDNF）的可用性和反应性，导致轴突再生受损。临床研究显示，T2DM患者循环NGF和BDNF水平显著降低，DN患者进一步下降，并与较长的病程、较高的空腹C肽、升高的HbA1c和增加的24小时尿微量白蛋白排泄相关。
4.4 髓鞘相关生物标志物
脱髓鞘性神经病中，大髓纤维损伤导致髓鞘相关基因表达降低，反映为循环mRNA（cmRNA）水平受损。临床数据支持循环髓鞘蛋白零（MPZ）mRNA作为DN大纤维受累的潜在生物标志物。DN患者MPZ cmRNA降低与痛觉减退相关，先于热和机械检测缺陷24个月，可能早于定量感觉测试或神经传导速度变化。
4.5 酶
神经元特异性烯醇化酶（NSE）是神经元和神经内分泌细胞中高表达的糖酵解酶。在神经元损伤时NSE释放至细胞外，并在外周血中可检测。糖尿病患者的血清NSE中度升高，DN患者则高度升高，且NSE升高独立于血糖水平或糖尿病病程，表明其与神经健康而非代谢控制更直接相关。前瞻性研究也证实了这些发现。
4.6 微RNA或MiRnome谱分析
微RNA（miRNA）是长度约18–24个核苷酸的非编码RNA，通过结合mRNA调控基因表达，并可分泌至血液和体液中，被RNA结合蛋白和脂质囊泡保护而高度稳定。在DN中，miR-21在多发性神经病患者白细胞中升高；miR-155在痛性神经病患者的坐骨神经和腓肠神经活检中显著升高，驱动胶质激活和轴突损伤；miR-146a在糖尿病状态下血清、白细胞、视网膜、心脏和外周神经系统中表达降低。胶质相关miRNA如miR-22-3p上调、miR-92b-3p下调与角膜神经丢失相关。单个miRNA往往反映广泛的系统性扰动，因此需转向对循环MiRnome（全局miRNA表达谱）的全面分析，以捕获炎症、氧化应激和代谢失调的复杂相互作用，并可能用于患者分层和监测治疗反应。
5. 体外方法研究糖尿病周围神经病变中的胶质和轴突损伤
DN同时影响神经元和胶质成分，因此体外神经元和胶质模型可用于研究糖尿病条件下诱导的早期致病事件。这些模型允许精确控制葡萄糖水平，实时评估氧化应激、线粒体功能障碍、神经炎症信号和轴突运输受损。结合形态学、分子和功能方法，包括微流体和电生理分析，可探索高血糖诱导的神经退行性过程，并鉴定与疾病发生、进展和治疗反应相关的候选生物标志物。体外模型可评价生物标志物的细胞来源、时间出现、与疾病机制的关系以及对干预的响应，例如NfL和PRPH可在高糖神经元模型中研究其释放动力学和与轴突变性的关系。
5.1 感觉神经元和施万细胞的原代培养
原代细胞培养能更接近动物体内生理，但存在种属差异。原代DRG感觉神经元是研究高糖诱导神经损伤的常用模型，高糖条件可重现神经突生长减少、线粒体片段化和凋亡标志物增加等糖尿病表型。原代施万细胞在糖尿病模拟条件下出现髓鞘蛋白（MBP、P0）下调、ROS产生增加和促炎细胞因子谱转变。然而，原代神经元是终末分化且脆弱的，施万细胞在几代后失去髓鞘表型，限制了长期研究。
5.2 共培养系统
将DRG神经元与施万细胞共培养可重建周围神经中神经元–胶质双向通讯。高糖条件下，NGF和BDNF等神经营养信号受损，导致轴突–髓鞘通讯异常，施万细胞包裹和髓鞘再生能力下降。代谢应激激活NF-κB或MAPK信号，释放细胞因子和ROS。条件培养基实验可剖析两个细胞群之间的分子对话，识别神经营养因子、细胞因子或细胞外囊泡等分泌介质。DRG神经元–施万细胞共培养为研究高糖如何干扰神经元–胶质通讯及测试恢复平衡的治疗策略提供了有力系统。
5.3 感觉和自主神经节的3D器官型培养
感觉神经节和自主神经节外植体保留了神经节结构、卫星胶质细胞和长距离轴突投影，可作为介于分离细胞和整体动物之间的中间平台。在三维器官型培养中，可施加持续高糖、AGEs或糖尿病血清，研究组织水平事件如胶质激活、轴突成束异常、神经元–胶质相互作用破坏和炎症。分离培养更适合机制性细胞自主研究，而外植体则更好地模拟糖尿病神经损伤和修复背后的复杂生理相互作用。
5.4 人诱导多能干细胞（hiPSC）培养
通过重编程患者皮肤成纤维细胞为多能干细胞，再分化为不同细胞类型，hiPSC技术可实现个体化疾病建模并减少种间差异。将hiPSC定向分化为感觉神经元和施万细胞谱系后，在高糖或氧化应激下可重现DN标志性特征，如神经突生长减少、离子通道表达改变、轴突运输受损和细胞凋亡增加。与施万细胞共培养可研究髓鞘形成缺陷、神经营养信号破坏和炎症反应。hiPSC衍生的患者特异性模型支持个性化医学，可用于研究个体易感性、基因或表观遗传修饰物，并筛选神经保护化合物。结合类器官、微流体“神经芯片”和三维共培养系统可进一步增强生理相关性。
6. 实验性糖尿病条件
体外模拟DN常采用高糖暴露和氧剥夺。高糖条件通常在25至150 mM葡萄糖范围内，可诱导氧化应激、线粒体功能障碍、神经突生长受损和炎症相关基因表达改变。必须使用等渗甘露醇对照以区分葡萄糖特异性效应与渗透压应激，并报告最终测量浓度。缺氧可通过化学法（二氯化钴CoCl
2稳定HIF-
1α）或物理法（低氧舱，通常1–5% O
2）诱导，与高糖结合可增强病理生理相关性。实验时间结构很重要：短期暴露揭示早期代谢和信号事件，长期暴露导致神经突回缩、轴突断裂、神经元凋亡和施万细胞去分化。应根据不同细胞类型选择合适的结局指标。可加入额外应激如AGEs、棕榈酸酯、炎症细胞因子或糖尿病血清，但应通过因子设计控制，以确定特定生物标志物变化的来源。模型质量取决于标准化和报告，包括传代次数、细胞密度、基质涂层、血清浓度和暴露时间。需区分生物学重复和技术重复，监测细胞活力和渗透压，并通过救援实验验证候选生物标志物与损伤通路的联系。
7. 评估细胞损伤的方法
7.1 形态学分析
免疫荧光结合共聚焦显微镜可可视化并定量神经元和胶质细胞的形态变化。神经元标志物如βIII-微管蛋白、外周蛋白和NfL用于评估神经突完整性，施万细胞标志物如S100β、髓鞘碱性蛋白（MBP）和P0反映髓鞘状态。图像分析软件如ImageJ Skeletonize、Neurite-J和NeurphologyJ可分别用于快速长度估计、复杂外植体分支分析和精细形状参数测量。结合使用这些工具可全面评估DRG模型中的神经突动力学和退化。
7.2 生化与分子研究
实时定量PCR（RT-qPCR）可分析神经营养信号通路（NGF、BDNF、TrkA、TrkB、p75NTR，以及下游PI3K–Akt和MAPK–ERK靶点）、氧化应激通路（SOD1、CAT、GPX1、Nrf2、HMOX1、NOX4、iNOS、COX2）、炎症信号（TNF-α、IL-1β、IL-6、MCP-1、NF-κB成分）和凋亡自噬通路（BAX、BCL2、CASP3、CASP9、Beclin-1、LC3）的转录改变。在施万细胞中还检测髓鞘相关基因（MPZ、MBP、Krox20、Sox10、ErbB2/3）。免疫印迹和ELISA可定量蛋白表达及分泌因子，分泌组分析通过多重ELISA或质谱鉴定细胞释放的介质，比较不同条件下促炎、神经营养和氧化应激相关分子谱。
7.3 电生理记录
膜片钳技术提供单细胞水平的高分辨率离子通道和动作电位分析，多电极阵列（MEA）实现非侵入性、长期监测网络电活动。两种方法互补，可捕获细胞和网络水平的电生理改变，增强体外DN模型的转译相关性并支持神经保护药物开发。
7.4 微流体平台
微流体平台通过微通道网络实现不同细胞类型的空间分离、化学梯度建立和局部刺激施加。在DN背景下，可隔离轴突与胞体，研究定向生长、细胞间相互作用、轴突变性、髓鞘缺陷和神经炎症。微流体平台兼容活细胞成像、免疫染色和电生理记录，适用于高内涵筛选和机制研究。
8. 讨论
DN涉及神经元和胶质成分的复杂进行性并发症。当前临床管理限于症状控制和风险因素修正，迫切需要可靠生物标志物指导早期干预。现有诊断工具多在结构损伤已发生后才能检出，存在亚临床期诊断缺口。神经元损伤生物标志物可在分子水平反映持续神经损伤，如NfL在神经传导异常可检出前已与早期轴突损伤相关。生物标志物有助于风险分层、个体化治疗和客观监测治疗反应。蛋白类标志物如NfL和NSE具有早期检测潜力。但整合入常规临床仍面临测定标准化、成本效益和临床阈值确定等挑战。体外模型可在受控条件下向特定细胞类型施加高糖或低氧等刺激，有助于解析细胞事件和发现新生物标志物。原代培养、共培养、三维器官型外植体以及hiPSC衍生的模型各具优势；器官型培养保留天然组织结构和细胞间接触，hiPSC系统保留患者特异性遗传背景。这些模型可作为发现和初步测试循环生物标志物的平台。
9. 结论
模拟体内糖尿病环境的先进体外模型对基础和转化研究均至关重要。它们不仅能精确剖析驱动DN的分子和细胞通路，还能在生理和糖尿病背景下评估和验证生物标志物的相关性。基于模型的策略可在受控糖尿病条件下发现候选生物标志物，将其与特定细胞和功能变化联系起来，并优先将其用于患者样本评估。从研究到临床转化需要标准化测定、在多样化人群中进行稳健验证以及明确的临床指南。未来研究应关注纵向评估和整合多标志物组合，以提高敏感性和特异性。最终，将早期神经损伤生物标志物纳入临床工作流程有望通过促进及时干预来改善DN患者预后并预防不可逆神经损伤。
