《International Journal of Molecular Sciences》：Use of Porphyrin Precursors as a Novel Approach for Detection of Mycobacterium tuberculosis
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结核病仍然是全球主要的传染病之一，因此新的方法正在被开发，以作为未来诊断方法的基础。一种有前景的策略依赖于将卟啉作为生物标志物，利用荧光光谱法检测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）。此前已有尝试基于微生物的卟啉产生能力对其进行
结核病仍然是全球主要的传染病之一，因此新的方法正在被开发，以作为未来诊断方法的基础。一种有前景的策略依赖于将卟啉作为生物标志物，利用荧光光谱法检测结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis）。此前已有尝试基于微生物的卟啉产生能力对其进行检测。然而，内源性卟啉产生不足限制了该方法在分枝杆菌检测中的应用。作为一项原理验证研究，研究人员探究了利用外源性前体增强卟啉积累的可行性，旨在通过荧光光谱法检测分枝杆菌的生长。这些前体的引入使荧光信号强度显著提高，从而能够检测结核分枝杆菌并识别潜在的污染。
**利用卟啉前体荧光检测结核分枝杆菌的研究解读**
**一、研究背景与问题**
结核病（Tuberculosis, TB）由结核分枝杆菌（Mycobacterium tuberculosis, Mtb）引起，是全球最严重的传染病之一。据世界卫生组织统计，2024年全球约有1070万人罹患结核病，123万人因此死亡，结核病已重新成为单一传染源导致死亡的首要原因，超过了2019冠状病毒病（COVID-19）。目前，结核病的诊断主要依赖痰涂片显微镜检查、分子生物学方法（如聚合酶链式反应检测）以及基于固体和液体培养基的培养方法。然而，这些方法各有局限：痰涂片镜检灵敏度低且无法区分Mtb与非结核分枝杆菌（Nontuberculous Mycobacteria, NTM）；分子检测虽快速灵敏，但成本较高；培养法虽然是金标准，却需要漫长的孵育时间。自动化液体培养系统（如BACTEC MGIT 960系统）通过检测氧敏感荧光传感器的信号变化来监测分枝杆菌生长，缩短了检出时间，但仍无法可靠地区分Mtb与其他细菌种类，且需要昂贵的设备和试剂。这些局限性凸显了开发更快速、高特异性新型诊断方法的迫切需求。
在众多微生物生物标志物中，卟啉（Porphyrins）因其独特的荧光特性而备受关注。卟啉是四吡咯大环化合物，作为血红素（Heme）——呼吸链中支持细胞氧化还原过程的关键组分——的前体，在微生物代谢中发挥重要作用。在大多数细菌中，血红素生物合成经由C5途径启动，其中分枝杆菌采用粪卟啉依赖性（Coproporphyrin-Dependent, CPD）途径。早在二十世纪中叶，研究人员就已在结核分枝杆菌中证实了卟啉的存在。内源性卟啉在索雷特带（Soret band，~400–410 nm）激发下可发出红色荧光，其发射光谱在580 nm、620 nm和685 nm处呈现三个特征峰，其中620 nm峰被归因于粪卟啉III（Coproporphyrin III），580 nm峰与锌-粪卟啉（Zn-coproporphyrin）相关。然而，内源性卟啉在分枝杆菌中合成缓慢，这一关键限制因素制约了其在检测中的应用。基于5-氨基乙酰丙酸盐酸盐（5-Aminolevulinic Acid Hydrochloride, ALA）能够诱导细菌细胞中卟啉合成的已知能力，研究人员提出假设：分枝杆菌与快速生长的污染微生物在ALA诱导的卟啉积累动力学和光谱特征上存在差异，这些差异可用于记录分枝杆菌生长并检测培养物污染。
**二、研究内容与意义**
本研究作为一项原理验证（Proof-of-Principle）研究，系统评估了利用外源性卟啉生物合成前体（ALA）增强卟啉积累、进而通过监测620 nm荧光强度和580/620 nm比值来检测Mtb H37Rv生长并区分常见污染微生物的可行性。研究结果证实，补充ALA可显著增强荧光信号，并且Mtb的光谱特征与五种常见污染微生物（金黄色葡萄球菌S. aureus、表皮葡萄球菌S. epidermidis、铜绿假单胞菌P. aeruginosa、肺炎克雷伯菌K. pneumoniae和白色念珠菌C. albicans）存在明显差异，为开发基于卟啉荧光的Mtb新型检测方法提供了实验依据。
**三、关键技术与方法**
研究使用了实验室标准菌株Mtb H37Rv（来源于俄罗斯国家肺结核与传染病医学研究中心微生物学实验室菌种库），在BACTEC MGIT 960系统中以Middlebrook 7H9液体培养基（添加OADC富集物，即油酸、白蛋白、葡萄糖和过氧化氢酶）培养至阳性信号后，调至0.5 McFarland浊度。污染微生物菌株（S. epidermidis、S. aureus、K. pneumoniae、P. aeruginosa和C. albicans）分别经选择性固体培养基（甘露醇盐琼脂、麦康凯琼脂和沙氏琼脂）预培养后，同样在含OADC的Middlebrook 7H9培养基中制备0.5 McFarland菌悬液。ALA以4 mM终浓度加入培养体系，样品在37 °C下孵育15天。荧光测量采用Enspectr L405便携式荧光光谱仪（激发波长405 nm，输出功率8 mW），每日同一时间通过管底采集荧光信号，信号累积时间为2秒。每种微生物在每个时间点均设10个独立重复（n=10）。数据分析采用重复测量方差分析（ANOVA），以物种和时间作为因子，显著性水平设为p<0.05。
**四、研究结果**
**（一）Mtb的荧光光谱特征与ALA的增强效应**
在Mtb培养物的荧光测量中，研究人员检测到三个特征荧光峰，最大值分别位于580 nm、620 nm和685 nm，而仅含OADC富集物和ALA但不含Mtb的阴性对照样品中未观察到这些光谱峰。620 nm处的荧光信号强度最高且与培养时间呈线性关系，因此被确定为主要监测标志物。ALA的添加显著加速了620 nm荧光强度的增长，并产生了较未添加ALA的样品更高的总体信号（p<0.01）。
**（二）Mtb培养过程中荧光信号的动态变化**
在15天的培养过程中，研究人员每日记录580 nm和620 nm处的荧光信号强度及其比值。培养前7天，580/620 nm比值的中位数未超过0.22，至第15天上升至0.36，表明在整个观察期内620 nm峰始终占主导地位，且其荧光信号随培养进程逐步增强。
**（三）Mtb与常见污染微生物的荧光特征差异**
通过比较Mtb H37Rv与五种常见污染微生物在620 nm荧光强度和580/620 nm比值两个参数上的差异，研究人员发现：S. epidermidis和S. aureus的620 nm峰分别在培养第2天开始增强，第4天达到最大值，且整体高于Mtb（S. aureus在第4天的620 nm信号约为Mtb的18倍，p<0.01）；K. pneumoniae的620 nm峰动力学与Mtb相当，但整体强度低于Mtb（p<0.01）；C. albicans的620 nm峰动力学与Mtb无显著差异（p>0.05）；P. aeruginosa的620 nm信号显著低于Mtb（p<0.01）。然而，所有五种污染微生物的580/620 nm比值均显著高于Mtb（S. epidermidis第15天比值超过3，S. aureus约0.94，K. pneumoniae为2.4，C. albicans为1.5，P. aeruginosa为4.4，而Mtb仅为0.34–0.36），表明这些微生物中580 nm峰相对于620 nm峰的增长更为显著。两个参数的互补性使得在各种情况下都能可靠地区分Mtb与污染微生物。
**五、讨论与结论**
本研究的发现与卟啉荧光在微生物检测和光动力应用领域的丰富前人工作一脉相承。从Kilian首次将ALA诱导的卟啉试验作为嗜血杆菌属（Haemophilus）独立诊断方法，到Lund和Blazevic的临床验证，再到后续在口腔鳞状细胞癌、慢性伤口感染、牙科结石检测等方面的广泛应用，卟啉荧光已被反复证明是诊断相关微生物负荷的有效手段。值得注意的是，Ivanova等人曾开发基于卟啉的分枝杆菌检测方法，但因分枝杆菌荧光信号微弱而受限，需借助表面活性剂（米拉米斯丁，Miramistin）释放胞内卟啉以增强可检测性；而本研究通过补充ALA前体直接增强了分枝杆菌自身的卟啉积累，提供了一种不同的解决思路。
从实际应用角度看，本方法在保留自动化培养系统基于荧光强度判断生长的原则基础上，增加了580/620 nm比值这一独立光谱参数，提高了在孵育期间识别污染的可能性，而非仅在事后回顾性发现污染，具有潜在的实用价值。在方法学层面，研究人员指出接种物以0.5 McFarland浊度标准化未必对应于严格的等效CFU/mL，以及预培养于不同选择性培养基可能对细胞初始代谢状态产生影响等局限性。未来研究方向包括扩大菌株范围至临床分离株、耐药菌株和非结核分枝杆菌，系统评估浓度-响应关系以确定最佳ALA浓度，以及深入表征ALA摄取、卟啉浓度和血红素途径关键酶活性等机制层面。
研究结论指出：本研究以原理验证的方式证实了基于卟啉荧光的Mtb检测方法的可行性，其机制基础是利用血红素生物合成途径。外源性补充卟啉前体5-氨基乙酰丙酸盐酸盐可显著增强荧光信号，大幅提高方法灵敏度。此外，Mtb与常见污染微生物之间光谱特征的差异为鉴定样本污染提供了额外依据。综上，本研究建立了一种整合血红素生物合成途径诱导与荧光光谱分析的新型Mtb检测方法的初步原理验证，其进一步验证需要对临床标本和更广泛范围的污染微生物进行研究。
