Dystrophin缺乏在mdx小鼠膈肌中营造促铁死亡环境并受饮食与糖皮质激素治疗调节

《Biomolecules》：Dystrophin Deficiency Creates a Pro-Ferroptotic Environment in Diaphragm of mdx Mice That Is Modified by Diet and Glucocorticoid Treatment

　　

杜兴氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）以进行性肌肉萎缩为特征，伴有铁稳态改变和脂质代谢失调。胰岛素抵抗和肥胖在DMD中常见，但其对疾病进展的影响，尤其是在糖皮质激素（glucocorticoid, GC）治疗期间，仍不清楚。铁死亡（ferroptosis，一种铁依赖性细胞死亡）在DMD肌肉病理中的作用仍不确定。研究人员假设铁死亡信号在mdx骨骼肌中会增加，高脂高蔗糖饮食（high-fat, high-sucrose diet, HFHSD）会进一步加剧该信号，而GC治疗会使其减弱。雄性C57和mdx小鼠被喂以对照饮食或HFHSD，添加或不添加泼尼松龙（prednisolone），持续19周，随后进行膈肌蛋白质印迹分析。与C57相比，营养不良性膈肌中转铁蛋白（transferrin）丰度增加131%（p = 0.0006）、转铁蛋白受体（transferrin receptor）增加72%（p = 0.0041）、铁蛋白重链（ferritin heavy chain）增加281%（p < 0.0001）、长链脂酰辅酶A合成酶家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4）增加36%（p = 0.0080）以及5-脂氧合酶（5-lipoxygenase）增加101%（p = 0.0016）。尽管存在这些促铁死亡变化，丙二醛（malondialdehyde）和4-羟基壬烯醛（4-hydroxynonenal）未发生改变。谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX₄）显著增加（800%，p < 0.0001），提示氧化还原平衡得以维持并抑制铁死亡。HFHSD未加剧铁死亡信号，而GC治疗部分抵消了疾病相关的铁处理和抗氧化蛋白变化。这些发现表明，营养不良性膈肌经历铁死亡应激，而这种应激受到主动约束，很可能通过代偿性GPX₄变化实现。

**研究背景与目的**

杜兴氏肌营养不良症（Duchenne muscular dystrophy, DMD）是由dystrophin蛋白缺乏引起的致死性进行性肌肉萎缩疾病，其肌膜（sarcolemma）脆弱，易发生收缩诱导损伤，进而破坏Ca²⁺和Fe²⁺/Fe³⁺稳态，促进氧化应激和肌肉变性。铁稳态失调可触发铁死亡（ferroptosis），一种铁依赖性、caspase非依赖的细胞死亡，由细胞内亚铁离子和脂质过氧化物积累引发。正常情况下，谷胱甘肽过氧化物酶4（glutathione peroxidase 4, GPX₄）通过抑制活性氧诱导的脂质过氧化来防止铁死亡。DMD常并发肥胖和胰岛素抵抗，且常使用糖皮质激素（glucocorticoid, GC）治疗。高脂饮食可增加多不饱和脂肪酸（polyunsaturated fatty acids, PUFAs）底物，GC也可能通过影响脂质组成和抗氧化防御而改变铁死亡敏感性，但它们在dystrophin缺乏背景下对铁死亡的影响尚不清楚。因此，本研究旨在评估mdx小鼠骨骼肌中的铁死亡信号，并探讨高脂高蔗糖饮食（HFHSD）和GC治疗对其的调节作用。

**研究内容与意义**

研究人员给雄性C57和mdx小鼠分别喂食对照饮食或HFHSD，加或不加泼尼松龙，持续19周，随后通过Western blot检测膈肌中铁处理蛋白、促铁死亡酶、脂质过氧化标志物和抗氧化蛋白。结果发现dystrophin缺乏创建了促铁死亡环境，但GPX₄大幅上调，可能维持氧化还原平衡并抑制铁死亡；GC降低铁处理蛋白并增强抗氧化防御；HFHSD未加剧铁死亡，反而降低脂质过氧化。这些发现揭示了铁死亡在DMD中被主动约束的机制，并强调代谢健康对疾病进展和治疗反应的重要影响。

**关键技术方法**

研究对象为雄性C57BL/10ScSnJ（C57）健康小鼠和mdx（C57BL/10ScSn-Dmd^mdx/J）小鼠（购自Jackson Laboratories）。6周龄时将mdx小鼠分为四组：对照饮食（CD）、CD+泼尼松龙（Pred，10 mg/L饮水）、HFHSD、HFHSD+Pred，另设C57 CD无Pred组作为健康对照，初始每组n=10，因长期饲养损耗最终每组n=7-10。25周龄时收集膈肌。采用Western blot检测蛋白相对丰度，以Ponceau S染色归一化，使用AzureSpot软件定量。统计采用SAS 9.4的PROC MIXED，分析饮食、治疗及其交互作用，并用预设计对比评估组间差异，p<0.05为显著。

**研究结果**

**铁处理蛋白和促铁死亡标志物在mdx膈肌中增加**

与C57对照（CCN）相比，mdx对照（MCN）膈肌中转铁蛋白增加131%（p = 0.0002）、转铁蛋白受体（transferrin receptor, TfR₁）增加72%（p = 0.0041）、铁蛋白重链（ferritin heavy chain, FTH₁）增加281%（p < 0.0001）；促铁死亡酶长链脂酰辅酶A合成酶家族成员4（acyl-CoA synthetase long-chain family member 4, ACSL₄）增加36%（p = 0.0080）、5-脂氧合酶（5-lipoxygenase, ALOX₅）增加101%（p = 0.0016），NADPH氧化酶4（NADPH oxidase 4, NOX₄）增加30%（p = 0.0372）。GC处理显著降低转铁蛋白（MCP较MCN降低35%，M