吸入性银杏叶精油在慢性应激小鼠模型中的抗氧化与抗炎效应：基于神经免疫、代谢及肠道菌群重塑的机制研究

《Plants》：Antioxidant and Anti-Inflammatory Effects of Inhaled Ginkgo biloba Leaf Essential Oil in a Chronic Stress Mouse Model: Insights from Neuroimmune, Metabolic, and Gut Microbiota Remodeling

　　

摘要 慢性应激通过神经内分泌、炎症、氧化、代谢及肠道菌群的协同紊乱诱导行为异常。植物来源的挥发性组分可能调节应激相关的神经行为反应，但其抗氧化与抗炎效应及相关神经生物学机制尚未得到充分表征。本研究采用水蒸气蒸馏法从阴干银杏叶中提取银杏叶精油（GbO），通过气相色谱-质谱联用（GC–MS）进行化学成分表征，并在慢性不可预知轻度应激（CUMS）小鼠模型中，结合行为学、生物化学、分子生物学、海马代谢组学及肠道菌群分析进行评价。顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME–GC–MS）初步鉴定出至少在两个独立提取批次中检出的70种挥发性成分，其中65种成分在全部批次中稳定检出。在CUMS小鼠中，吸入GbO，尤其是较高暴露剂量组，可减轻抑郁样及焦虑样行为异常，且不改变总体自主活动能力。GbO可降低血清皮质酮及外周和海马促炎细胞因子水平，缓解海马氧化失衡，并降低离子钙结合适配器分子1（Iba-1）和胶质纤维酸性蛋白（GFAP）信号。上述变化伴随核因子κB（NF-κB）活化的减弱、核因子E2相关因子2/血红素加氧酶-1（Nrf2/HO-1）相关抗氧化信号的增强，以及脑源性神经营养因子/原肌球蛋白受体激酶B/cAMP反应元件结合蛋白（BDNF/TrkB/CREB）相关神经营养信号和突触后密度蛋白95（PSD95）相关突触完整性的改善。海马代谢组学进一步显示，应激相关的神经递质、脂质、炎症及能量/氧化还原代谢紊乱得到部分纠正，而16S rRNA测序则揭示肠道菌群多样性和群落结构的部分恢复。综上，这些发现表明，吸入GbO在CUMS小鼠中发挥抗氧化和抗炎效应，并与神经免疫、神经营养、代谢及肠道菌群的多层次协同重塑相关联。

吸入性银杏叶精油在慢性应激小鼠模型中的抗氧化与抗炎效应：基于神经免疫、代谢及肠道菌群重塑的机制解读

一、研究背景与科学问题

慢性应激是抑郁相关神经行为障碍的重要诱发因素，可导致快感缺失、行为绝望、焦虑样回避及动机障碍等一系列行为异常。除经典的单胺能功能障碍外，慢性应激已被认识到可驱动神经内分泌活动、免疫信号、氧化平衡、神经可塑性、代谢及肠道微生态的多层次协同改变。其中，应激诱导的外周炎症激活和海马神经炎症可与下丘脑-垂体-肾上腺（HPA）轴激活、胶质细胞反应性、氧化应激及突触可塑性损伤相互作用，形成多水平的应激-免疫-脑调控网络。

海马对慢性应激高度敏感，在情绪调节、应激适应和神经可塑性中发挥核心作用。慢性不可预知轻度应激（CUMS）可诱导抑郁样和焦虑样行为，并伴随海马小胶质细胞激活、炎症细胞因子上调、突触丢失及神经元活性降低。星形胶质细胞同样参与抑郁相关神经炎症和神经可塑性调控。这些神经免疫改变与神经营养信号受损、突触结构破坏及海马代谢重塑密切相关。

肠道菌群已成为应激相关神经免疫和代谢反应的重要调控因素。应激诱导的菌群改变可促进免疫异常和海马小胶质细胞激活，进而促成抑郁样行为。肠道菌群重塑可促进应激诱导抑郁的恢复，菌群来源代谢物可重编程色氨酸代谢并调节小鼠抑郁样行为。然而，肠道菌群改变、海马代谢重塑、神经免疫反应与慢性应激行为异常之间的关系仍未完全阐明。

植物来源挥发性化合物是一类具有生物活性的芳香暴露物，可能通过嗅觉通路、呼吸道吸收、体循环或感觉调节影响神经行为反应。银杏叶含有多种具有抗氧化、抗炎和神经保护潜力的生物活性成分，但现有研究多集中于标准化非挥发性提取物，其挥发性组分的药理作用研究仍十分有限。基于此，研究人员提取银杏叶精油（GbO），在CUMS小鼠模型中系统评价吸入GbO对慢性应激诱导的神经行为异常及相关神经免疫、代谢和肠道菌群改变的调节作用。

二、研究设计与主要技术方法

研究人员采用水蒸气蒸馏法从阴干银杏叶中提取GbO，利用顶空固相微萃取-气相色谱-质谱联用（HS-SPME–GC–MS）对三个独立提取批次进行化学成分表征。通过探索性网络药理学和分子对接分析优先筛选潜在化合物-靶点关系。动物实验使用SPF级雄性C57BL/6J小鼠（8周龄，18–22 g，购自长春亿斯实验动物技术有限公司），随机分为对照组、CUMS组、CUMS+氟西汀（Flu）组、CUMS+GbO低暴露组（GbO-L）和CUMS+GbO高暴露组（GbO-H），每组12只。CUMS造模持续42天，第28天至第42天给予Flu（10 mg/kg/d灌胃）或GbO（10 μL或30 μL每日被动吸入30 min）治疗。研究综合运用行为学测试（旷场实验、高架十字迷宫、蔗糖偏好实验、悬尾实验、强迫游泳实验）、组织学染色（H&E、尼氏、高尔基染色）、免疫荧光、Western blot、ELISA、qRT-PCR、海马非靶向液相色谱-质谱联用（LC–MS）代谢组学、16S rRNA基因测序及多组学关联分析等技术方法。

三、主要研究结果

3.1 精油化学成分表征

HS-SPME–GC–MS初步鉴定出70种挥发性成分，其中65种在三个批次中稳定检出，涵盖萜烯、醇、醛、酮、烷烃、羧酸、酯类等。相对响应较高的成分包括六氢法尼基丙酮、亚麻酸甲酯、(E)-橙花叔醇、正二十五烷、植醇和香叶基丙酮。

3.2 网络药理学与分子对接

网络药理学分析鉴定出9个GbO预测靶点与抑郁障碍相关基因的重叠基因，包括Nr3c1、Slc5a7、Oprm1、Htr3b、Chrm2、Slc6a4、Drd2、Htr1a和Oprk1。分子对接显示α-杜松醇与NR3C1结合评分最优（?8.0 kcal/mol），香叶醇与OPRM1结合评分?5.3 kcal/mol。

3.3 GbO改善CUMS小鼠抑郁样和焦虑样行为

行为学测试显示，CUMS显著降低蔗糖偏好、增加悬尾和强迫游泳不动时间、减少高架十字迷宫开臂探索和旷场中央区停留时间。GbO治疗，尤其GbO-H组，显著逆转上述行为异常，且各组总运动距离无显著差异，排除了运动能力改变的干扰。

3.4 GbO缓解海马形态学改变和生化异常

组织学染色显示CUMS小鼠海马CA1、CA3和DG区神经元排列紊乱、尼氏体染色减弱、树突棘密度显著降低。GbO治疗部分恢复上述形态学改变。生化检测显示GbO降低血清皮质酮及外周和海马促炎细胞因子（TNF-α、IL-6、IL-1β），恢复谷胱甘肽（GSH）、超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）水平并降低丙二醛（MDA），同时恢复海马γ-氨基丁酸（GABA）、5-羟色胺（5-HT）和脑源性神经营养因子（BDNF）水平。

3.5 GbO减轻海马胶质细胞激活和炎症-氧化信号改变

免疫荧光显示CUMS增加Iba-1和GFAP荧光强度，GbO降低二者信号。qPCR显示GbO下调Il1b、Il6、Tnf、Aif1和Gfap mRNA表达。Western blot显示GbO降低磷酸化核因子κB（p-NF-κB）/NF-κB比值，增加核因子E2相关因子2（Nrf2）和血红素加氧酶-1（HO-1）蛋白水平。

3.6 GbO改善海马神经元状态和突触可塑性

免疫荧光显示CUMS降低NeuN和BDNF荧光强度，GbO恢复二者信号。qPCR显示GbO-H恢复Bdnf、Creb1和Dlg4 mRNA表达。Western blot显示GbO恢复BDNF和突触后密度蛋白95（PSD95）水平，提高磷酸化原肌球蛋白受体激酶B（p-TrkB）/TrkB和磷酸化cAMP反应元件结合蛋白（p-CREB）/CREB比值。

3.7 GbO调节海马整体代谢谱

海马代谢组学分析显示CUMS诱导广泛的代谢紊乱，GbO-H治疗部分逆转应激改变的代谢特征。差异代谢物主要富集于核苷酸代谢、嘌呤代谢、甘油磷脂代谢、泛酸和辅酶A生物合成及维生素B6代谢通路。

3.8 GbO反向调节CUMS诱导的关键海马代谢改变

45种代谢物在CUMS组显著上调后被GbO-H下调，53种代谢物在CUMS组下调后被GbO-H恢复。功能整合分析显示这些代谢物主要涉及神经递质代谢、炎症脂质介质和花生四烯酸代谢、氧化还原平衡和线粒体能量代谢及膜磷脂和信号分子。

3.9 GbO重塑CUMS小鼠肠道菌群组成和相关性网络

16S rRNA测序显示CUMS降低菌群α多样性（Chao、Sobs、Shannon指数），GbO-H显著恢复。门水平上，CUMS增加变形菌门相对丰度，降低厚壁菌门、放线菌门和Patescibacteria丰度，GbO-H部分纠正。属水平上，GbO-H部分恢复乳杆菌属等有益菌丰度并降低肠球菌属、埃希氏菌-志贺氏菌属等应激相关菌属。菌群共现网络分析显示GbO-H部分恢复CUMS破坏的菌群网络复杂性和连通性。

3.10 多组学关联分析

Spearman相关分析显示乳杆菌属与促炎细胞因子负相关、与GABA、5-HT和BDNF正相关。Procrustes分析证实肠道菌群与海马代谢组谱显著一致（M2=1.1774，p=0.001）。菌群-代谢物相关性网络揭示神经递质代谢、胆碱能信号、炎症脂质介质、氧化应激及能量代谢相关代谢物与特定菌属的显著关联。

四、讨论与结论

讨论部分指出，吸入GbO在CUMS小鼠中发挥抗抑郁样和抗焦虑样效应，伴随海马神经免疫、神经营养、代谢谱和肠道菌群结构的多层次协同改变。网络药理学和分子对接结果作为探索性假设生成工具，为后续验证提供候选化合物-靶点关系。研究强调NF-κB、Nrf2/HO-1和BDNF/TrkB/CREB通路的功能耦合状态，而非简单线性级联。肠道菌群分析提供分类学而非直接功能信息，菌群相关性网络反映关联模式而非直接生态互作。吸入途径方面，10 μL和30 μL代表名义腔室装载量而非实测空气浓度或实际吸入剂量，挥发性成分的个体差异和实际体内暴露水平尚不明确。研究局限性包括多组学关系的相关性本质、缺乏通路抑制或遗传操作验证、仅纳入雄性小鼠、H&E和尼氏染色作为支持性而非定量证据。

研究结论：吸入GbO可减轻CUMS诱导的小鼠抑郁样和焦虑样行为异常。这些行为效应伴随海马神经免疫、氧化和神经营养反应的协同改善，以及海马代谢和肠道菌群的部分重塑。基于相关性的多组学分析进一步将菌群和代谢改变与神经生物学指标联系起来，支持整合的应激-免疫-代谢-菌群反应框架。这些发现为吸入GbO在慢性应激条件下的神经行为效应提供了实验证据，同时强调需要进一步的成分水平、药代动力学和因果验证。