植物内生真菌Arthrinium sp. HS66来源的Terpestacin型Sesterterpenoids Arthritacins A–J的发现与半合成研究

《Journal of Fungi》：Discovery and Semisynthesis of Arthritacins A–J—Terpestacin-Derived Sesterterpenoids from the Plant Endophytic Fungus Arthrinium sp. HS66

　　

Arthrinium属物种是萜类化合物（terpenoids）的有前景的生产者，可产生具有多样化骨架和显著药理活性的产物。本研究从分离自旱生香茶菜（Isodon xerophilus）茎部的内生真菌Arthrinium sp. HS66中获得了10个尚未被描述的terpestacin型二倍半萜（sesterterpenoids）——arthritacins A–J（1–10），以及5个已知类似物（11–15）。通过综合波谱分析、半合成（semisynthesis）和核磁共振（NMR）计算确定了这些化合物的结构，并进一步通过DP4+概率分析加以验证。半合成研究还有助于确证terpestacin衍生物中此前在生物合成途径上不明确的C-11和C-23位构型。研究人员对所有化合物进行了抗人神经母细胞瘤（neuroblastoma）细胞的细胞毒活性评价。其中，化合物1、2、4、6、7、9、12和13表现出中等的抗增殖（antiproliferative）效应，其半数抑制浓度（IC₅₀）值范围为21.13至36.54 μM。

**论文解读**

**一、研究背景与问题**

内生真菌（endophytic fungi）广泛分布于植物组织中，与宿主建立互利共生关系，同时也是结构多样、具有生物活性的天然产物的重要来源。在众多内生真菌中，Arthrinium属（约88个种）以产生萜类（terpenoids）、生物碱（alkaloids）和聚酮（polyketides）等次级代谢产物而著称，这些化合物具有抗肿瘤、抗炎和抗菌活性。其中，terpestacin衍生的二倍半萜是该属真菌的一类特征性代谢产物，具有罕见的5/15双环骨架和独特的十八氢环戊[15]轮烯（octadecahydrocyclopenta[15]annulene）母核。自1993年首次报道以来，terpestacin因作为新型合胞体形成抑制剂具有抗HIV潜力，以及通过靶向线粒体复合体III的UQCRB蛋白选择性抑制肿瘤血管生成而备受关注。此外，带有L-氨基酸残基的新型terpestacin衍生物对U87MG来源的胶质母细胞瘤干细胞（glioblastoma stem cells）显示出良好的活性。

然而，迄今为止仅报道了约20个天然terpestacin类似物，且大多数成员的绝对构型——尤其是手性中心C-11和C-23——仅通过生物合成途径分析初步指定，缺乏可靠的实验验证。此外，对于含有柔性大环和侧链的terpestacin衍生物，ROESY相关信号在构型归属上可能不可靠。因此，亟需通过更可靠的方法对这些化合物的绝对构型进行确证。

**二、研究概述**

研究人员从采自云南昆明植物园的旱生香茶菜（Isodon xerophilus）新鲜茎部分离得到内生真菌Arthrinium sp. HS66（GenBank登录号MT355097），从其固体大米发酵产物中获得了10个新terpestacin型二倍半萜，命名为arthritacins A–J（1–10），以及5个已知类似物：neofusistacin（11）、maydistacin D（12）、terpestacin B（13）、fusaproliferin（14）和terpestacin（15）。其中，化合物2和3是首次发现的含有氢过氧基（hydroperoxy group）的terpestacin衍生物。研究人员通过半合成策略从主要成分terpestacin（15）出发合成了其中10个衍生物，从而确证了生物合成上保守手性中心（C-1、C-11、C-15和C-23）的构型，并结合NMR量化计算与DP4+概率分析确定了所有新化合物的绝对构型。最后，对所有化合物进行了抗人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞的细胞毒活性评价。该研究为terpestacin衍生物的构型确证提供了可靠策略，并首次报道了此类化合物对神经母细胞瘤的抑制活性。

**三、关键技术方法**

研究人员采用ITS rDNA测序鉴定菌株，以固体大米培养基进行大规模发酵（28°C，30天）；经甲醇提取、乙酸乙酯萃取、硅胶柱层析、RP-18反相柱层析、Sephadex LH-20凝胶柱层析及半制备型高效液相色谱（HPLC）分离纯化化合物；通过1D/2D NMR、HRESIMS、ECD、UV和IR等波谱手段进行结构表征。半合成方面，以terpestacin（15）为起始原料，采用m-CPBA进行环氧化反应获得化合物1、11、12和13，利用亚甲基蓝（methylene blue）为光敏剂的Schenck ene光氧化反应获得氢过氧化物2和3，再以三苯基膦（Ph₃P）还原得到4–6，并通过酸催化环氧开环反应由12获得9。构型确定采用Crest构象搜索、DFT几何优化（B3LYP-D3BJ/6-31G(d)）、单点能计算（M06-2X-D3/def2-TZVP）、GIAO方法NMR屏蔽张量计算（mPW1PW91-SCRF/6-31+G(d,p)）及DP4+概率分析。细胞毒活性采用MTS法评价，以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株（购自ATCC）为模型，阿霉素（doxorubicin）和紫杉醇（paclitaxel）为阳性对照。

**四、研究结果**

**4.1 结构表征**

通过HRESIMS确定分子式、1D/2D NMR综合分析（包括¹H-¹H COSY、HSQC和HMBC），研究人员逐一确定了化合物1–10的平面结构。化合物1为terpestacin中Δ^3,4-双键环氧化产物；化合物2和3为首次发现的含氢过氧基（–OOH）的terpestacin衍生物，其中2的氢过氧基位于C-7位（δ_C 87.3）、Δ^8,21-双键，3的氢过氧基位于C-8位（δ_C 85.0）、Δ^6,7-双键且H-6/H-7间的大耦合常数（J = 16.0 Hz）确证了6E构型；化合物4和5为C-7位差向异构体，含有C-7羟基和Δ^8,21-双键；化合物6和7为C-8位差向异构体，含有C-8羟基和Δ^6,7-双键；化合物8含有C-7羟基和Δ^8,9-双键；化合物9含有C-7羟基和Δ^12,22-双键；化合物10含有C-8羟基和Δ^13,14-双键，且H-13/H-14间的大耦合常数（J = 15.6 Hz）确证了13E构型。

**4.2 半合成研究**

研究人员提出化合物1–10的生物合成途径：terpestacin的三个双键分别发生选择性环氧化（A–C环）和自发的Schenck ene反应及后续还原转化（Scheme 1）。为确证这一途径并验证保守手性中心的构型，研究人员开展了系统的半合成研究。以terpestacin（15）为底物，m-CPBA环氧化反应不仅得到目标产物1、11和12，还出人意料地生成了13（4%产率）；12经3N HCl处理通过酸催化环氧开环获得9。以亚甲基蓝为光敏剂、1000 W高压钠灯照射条件下的Schenck ene光氧化反应成功获得氢过氧化物2和3，以及2的C-7差向异构体16；随后以Ph₃P还原2、3和16分别得到4、6和5。所有半合成产物的NMR数据、比旋光度和ECD曲线均与天然分离物一致，为所有新化合物中生物合成保守手性中心（C-1、C-11、C-15和C-23）的构型提供了有力支持。此外，鉴于天然arthritacins A–J的低产率以及半合成结果，研究人员初步提出这些化合物为非酶促自发氧化产物；当纯化的terpestacin在无溶剂条件下暴露于空气中数周后，也可检测到1–13的生成，提示terpestacin大环骨架中的三个双键对氧和光敏感，应在避光隔氧条件下保存。

**4.3 构型确定**

基于生物合成途径分析和半合成结果，新化合物的绝对构型问题被聚焦到五个关键化合物（1、4、6、8和10）上。由于ROESY相关信号存在歧义，化合物8的Δ^8,9-双键构型不确定，共产生四个候选结构（Figure 3）。研究人员通过NMR化学位移计算结合DP4+概率分析，以相关系数（R²）、平均绝对误差（MAE）和校正平均绝对误差（CMAE）进行统计评估，最终确定候选结构1a、4b、6b、8c和10a在所有候选结构中具有最高的DP4+（全数据）概率。至此，所有新化合物的绝对构型得以完整确证。

**4.4 细胞毒活性**

所有化合物（1–15）均以人神经母细胞瘤SH-SY5Y细胞株进行细胞毒活性评价。其中8个化合物（1、2、4、6、7、9、12和13）表现出中等的细胞毒活性，IC₅₀值范围为21.13至36.54 μM。初步构效关系分析表明：母体化合物terpestacin（15）及其24-O-乙酰基衍生物fusaproliferin（14）均无活性（IC₅₀ > 40 μM），提示完整的大环三烯骨架不足以产生活性，且游离的C-24羟基并非必需基团；相比之下，除3、5、8、10和11外，所有在大环骨架上带有额外含氧官能团的化合物均表现出中等细胞毒活性，表明大环双键的氧化修饰是对SH-SY5Y细胞产生活性的必要条件。

**五、总结与讨论**

该研究从植物内生真菌Arthrinium sp. HS66中分离鉴定了一系列terpestacin型二倍半萜，并建立了以terpestacin为起始原料的半合成路线，成功获得了10个该类衍生物。半合成策略为确证terpestacin衍生物中生物合成保守手性中心（C-1、C-11、C-15和C-23）的构型提供了确凿证据。基于此，NMR计算结合DP4+分析进一步确定了所有新化合物的绝对构型，为未来terpestacin衍生物的构型研究建立了可靠的方法学框架。在生物活性方面，该研究首次报道了terpestacin型二倍半萜对神经母细胞瘤的抑制活性。神经母细胞瘤是儿童中常见的一种恶性肿瘤，本研究结果提示该类化合物可作为开发新型抗神经母细胞瘤药物有前景的化学骨架，并指出了大环双键氧化修饰这一结构优化方向。此外，研究揭示了terpestacin对光和氧的敏感性，提示该化合物及其衍生物的储存和后续结构修饰需在避光隔氧条件下进行，同时建议未来的结构修饰应聚焦于这三个敏感双键以产生更多结构多样的terpestacin类似物。

**研究结论：** 从植物内生真菌Arthrinium sp. HS66中共分离获得15个terpestacin型二倍半萜，包括10个新化合物——arthritacins A–J（1–10）。其中化合物2和3是首次发现的具有独特氢过氧基的terpestacin衍生物。通过以terpestacin为起始原料的半合成获得了其中10个同类物，从而明确确证了terpestacin类似物中生物合成保守手性中心（C-1、C-11、C-15和C-23）的构型。基于这些结果，NMR计算结合DP4+分析进一步确证了所有新化合物的绝对构型。这些发现为未来terpestacin衍生物生物学功能的研究奠定了坚实的结构框架。