《Cell Reports Methods》：Self-amplifying RNA enables rapid, durable, integration-free programming of hiPSCs
编辑推荐：
摘要专业翻译：
对人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）进行遗传修饰是测量和操控细胞过程的有力手段。传统的hiPSCs基因工程方法涉及转染、筛选和扩增等繁琐流程，这些流程可能导致核型异常或分化
摘要专业翻译：
对人诱导多能干细胞（human induced pluripotent stem cells，hiPSCs）进行遗传修饰是测量和操控细胞过程的有力手段。传统的hiPSCs基因工程方法涉及转染、筛选和扩增等繁琐流程，这些流程可能导致核型异常或分化过程中的转基因沉默。使用自扩增RNA（self-amplifying RNA，saRNA）是一种潜在的非整合性替代方案，能够实现转基因的持久表达。在本研究中，研究人员利用saRNA向hiPSCs递送转录因子和功能性报告探针，并证实蛋白表达可维持数周之久。具体而言，saRNA递送能够实现由Ngn2诱导的神经元（induced neurons，iNs）的高效前向编程，并可随时间推移测量功能性报告探针信号。研究还表明，在hiPSCs中单次转染编码jRCaMP1b的saRNA，即可在向三维心脏球体（3D cardiac spheroids）分化的全过程中维持持久的报告探针表达，从而实现对心肌细胞功能和药物反应的追踪。综上所述，本研究的系统性分析表明，saRNA可延长hiPSCs中的转基因表达时间，为在临床相关模型系统中实现非整合性的细胞命运编程和功能性报告探针测量提供了有力支持。
论文解读文章：
一、研究背景与科学问题
基因编码的报告探针和转录因子是测量和调控细胞功能与命运的重要工具。转基因递送方式的选择决定了细胞工程的可扩展性、持久性和精准度。瞬时递送RNA和质粒虽能实现快速、非整合性的表达，但不适用于需要持续数天或数周表达的应用场景。相反，利用可编程核酸酶、转座子或慢病毒进行转基因整合虽能支持持久表达，却需要耗时费力的细胞系工程和筛选策略，可能影响细胞生理状态。此外，克隆细胞系所需的长期培养会加剧单细胞瓶颈效应，诱发遗传漂变，给多株hiPSC系的构建与比较带来挑战。虽然着陆垫（landing-pad）hiPSC系可简化细胞系构建流程，但其初始建立和验证需耗时数月，限制了该方法的固有可扩展性。整合型方法还常导致转基因沉默，限制了hiPSCs在长期基因表达、治疗性基因递送及其他合成生物学应用中的使用。腺相关病毒（AAV）虽能部分解决上述问题，但其包装容量小，无法递送大片段基因，且生产需优化，限制了大规模应用。修饰mRNA（modRNA）支持瞬时表达场景，但需多次转染才能获得持久响应，影响可扩展性和细胞活力。相比之下，自扩增RNA（saRNA）在低剂量下即可实现更高表达且具有持久性优势，但此前缺乏对saRNA作为hiPSCs操控工具的系统性表征。因此，本研究旨在系统测试saRNA递送转基因的能力，以弥合快速非整合性递送与持久蛋白表达之间的鸿沟。
二、研究内容与主要结论
研究人员系统测试了saRNA在多种场景下的转基因递送能力。与modRNA或质粒DNA（pDNA）转染相比，saRNA能在hiPSCs中诱导持久的转基因表达，且不影响细胞活力或多能性标志物。单次转染编码Ngn2的saRNA即可在6天内高效地将hiPSCs前向编程为神经元。研究还证明，saRNA递送编码功能性报告探针可实现hiPSC来源心肌细胞（CMs）、心脏球体及原代小鼠海马外植体中的关键生理指标测量。稀疏标记使得在报告探针递送30天后仍可在三维心脏球体内实现单细胞分辨率的细胞生理测量。该研究的重要意义在于，saRNA介导的递送实现了快速、持久的转基因表达，大幅提升了hiPSC工程的速度和可扩展性，为多种应用提供了新的技术平台。
三、关键技术方法
研究人员使用了以下主要技术方法：基于委内瑞拉马脑炎病毒（VEE）非结构蛋白（nsP1–nsP4）的saRNA体外转录合成体系；Lipofectamine介导的hiPSCs转染；抗生素（嘌呤霉素/博来霉素）筛选富集saRNA表达细胞；流式细胞术定量转染效率、细胞活力和多能性标志物；bulk RNA测序评估先天免疫应答；免疫荧光染色和共聚焦显微镜成像；hiPSC悬浮球体培养及心脏分化方案；原代小鼠海马外植体培养体系；RT-qPCR检测神经元基因表达；药物干预（普萘洛尔和异丙肾上腺素）结合钙成像评估心脏球体功能。
四、研究结果
1. saRNA在hiPSCs中实现高效、持久的转基因表达
研究人员合成了源自VEE病毒的saRNA，并与modRNA和pDNA递送方式进行了比较。结果显示，saRNA递送实现了最高的转基因表达水平，eGFP平均表达量分别比modRNA和pDNA高9.4倍和26.3倍。三种递送方式均保持了高细胞活力和正常形态，OCT4和SSEA-4等多能性标志物水平相似。RNA测序显示saRNA转染会诱导干扰素刺激基因（如IFIT1、OAS1、MX1）表达升高，但不影响细胞活力和多能性。通过嘌呤霉素或博来霉素筛选，可在4天时获得超过90%的eGFP阳性细胞。saRNA表达细胞在无筛选条件下可维持荧光表达至少7天。在三维悬浮培养中，嘌呤霉素筛选可产生高比例eGFP表达细胞，而无筛选条件下可实现稀疏标记。
2. saRNA介导的Ngn2递送高效分化hiPSCs为神经元
研究人员合成了编码Ngn2-P2A-eGFP的saRNA并转染hiPSCs，结合48小时嘌呤霉素筛选，在6天内实现了超过90%的TUJ1阳性细胞比例。免疫荧光显示诱导神经元（iNs）表达成熟神经元标志物MAP2。RT-qPCR证实Ngn2和eGFP转基因表达，并激活了BRN2和ISL1等神经元基因。与eGFP对照saRNA相比，Ngn2-P2A-eGFP saRNA转染的细胞表现出典型的神经元形态、紧凑球形细胞核和神经突起投射。
3. saRNA实现原代和hiPSC来源细胞中功能性报告探针的表达
研究人员构建了编码ASAP5（膜定位电压报告探针）、jRCaMP1b（胞质钙报告探针）和HyPer7（线粒体靶向氧化还原传感器）的saRNA。在hiPSC来源心肌细胞中，ASAP5信号定位于细胞膜，去极化时荧光降低，呈现节律性模式，与心肌细胞动作电位特征一致。在原代小鼠海马外植体神经元中，ASAP5检测到自发的亚阈值突触电位。jRCaMP1b在心肌细胞中显示节律性钙瞬变，在神经元中显示随机活性，信号波动幅度和动力学与既往报道一致。HyPer7传感器成功定位于线粒体并响应过氧化氢刺激。
4. saRNA递送报告探针实现hiPSC来源三维心脏球体的功能读出
saRNA编码的蛋白表达在心脏分化过程中持续超过30天。第14天时，免疫荧光显示心肌细胞标志物Nkx2.5和心肌肌钙蛋白T（cTnT）的强表达，且eGFP阳性细胞呈现清晰的肌节横纹模式。24小时嘌呤霉素筛选显著提高了第14天时的标记比例。稀疏标记的jRCaMP1b心脏球体在第14天可同时测量单细胞水平的非收缩性钙波动和整个球体的收缩耦合钙瞬变。药物实验表明，普萘洛尔使钙峰数量减少77.3%，异丙肾上腺素使钙峰数量增加257%，对照组无显著变化。从第14天到第30天，搏动率增加，但钙衰减动力学无显著差异，与hiPSC来源心肌细胞功能成熟度不足的已知特征一致。第30天时传感器亮度足以支持50 Hz帧率的快速动力学测量。
五、讨论与结论
本研究表明，saRNA是一种快速、简便、稳健且非整合性的转基因递送方法，为hiPSC工程提供了更具可扩展性的解决方案。与需要每日转染10天才能达到约70% TUJ1阳性率的modRNA方案相比，saRNA单次转染6天即可实现超过90%的TUJ1阳性率，体现了显著优势。saRNA作为已获FDA批准用于患者给药的非整合性载体，可能为hiPSC来源神经元的细胞治疗转化提供更好的可扩展性和安全性。在三维心脏球体中，saRNA递送实现了稀疏传感器标记和持久信号，避免了重复给药，支持长期安全研究的动态测量。未来可通过SGP调控实现翻译前控制，或通过融合TMP响应性降解结构域实现翻译后控制，以精确调节转基因表达水平。saRNA诱导的炎症反应可通过修饰核苷酸合成、共表达痘苗病毒E3L dsRNA结合蛋白或适应性进化等免疫逃逸策略加以缓解。
研究结论： 本研究表明，saRNA是一种快速、简单、稳健且非整合性的转基因递送方法，为hiPSCs工程提供了更具可扩展性的解决方案。随着saRNA工具在该领域的更广泛应用，有望加速发育生物学、疾病研究和药物筛选领域的创新与发现。
