液相色谱-高分辨质谱-荧光检测联用分析硫酸化唾液酸：EAD鉴别8-O-/9-O-硫酸化异构体及新型硫酸化乙酰化Neu5Gc的发现

《BBA Advances》：Analysis of Sulfated Sialic Acids by Liquid Chromatography Coupled with High-Resolution Mass Spectrometry and Fluorescence Detection

　　

截至目前，除O-乙酰化唾液酸外，尚无针对其他修饰唾液酸的液相色谱-质谱（LC-MS）分析方法。研究人员将用于O-乙酰化唾液酸的DMB-LC-MS平台扩展应用于O-硫酸化唾液酸。通过电子活化解离（EAD）分析，成功区分了8-O-和9-O-硫酸化唾液酸异构体。此外，首次证实了一种同时含有硫酸化和乙酰化修饰的新型N-羟乙酰神经氨酸（Neu5Gc）结构的存在。

唾液酸（sialic acid）是一类九碳酸性单糖，多以糖缀合物末端形式存在，其结构多样性来自C5位取代基种类（N-乙酰神经氨酸，Neu5Ac；N-羟乙酰神经氨酸，Neu5Gc；脱氨基神经氨酸，Kdn）、各种修饰（O-乙酰化、O-硫酸化、O-甲基化等）、糖苷键连接方式及聚合度。其中O-乙酰化唾液酸已有较成熟的LC-MS分析方法，而O-硫酸化唾液酸（SiaS）虽然在海胆配子识别、精子运动等生物学过程中具有重要作用，并已鉴定出O-硫酸基转移酶Wscd1和Wscd2，但缺乏系统的定性和定量分析手段，尤其是难以区分硫酸化位点（如C8与C9）以及无法鉴定未知结构。为此，研究人员在前期建立的DMB（1,2-二氨基-4,5-亚甲二氧基苯）衍生化在线LC-MS平台基础上，将其扩展用于O-硫酸化唾液酸分析，结合高分辨色谱分离、荧光检测和两类碎裂模式（碰撞诱导解离，CID；电子活化解离，EAD），旨在建立能同时实现灵敏检测和精细结构鉴定的SiaS分析平台，并应用于实际生物样本。

该研究使用的主要技术方法包括：对游离唾液酸进行DMB荧光衍生化；采用CAPCELL PAK ADME色谱柱在0.1%甲酸水-乙腈/甲醇体系下进行180 min梯度分离，柱后串联荧光检测器和ZenoTOF 7600高分辨质谱；负离子模式用于高灵敏定量和多反应监测（MRM-HR）；正离子模式向流动相中加入醋酸钠形成钠加合物，分别采用CID和EAD碎裂以获得结构诊断离子。样本来源为海胆精子和卵子，经酸水解、C18柱纯化、DEAE-Sephadex A-25阴离子交换色谱按电荷数分级、脱盐后衍生化分析。

### 2.1 使用标准品开发SiaSs的液相色谱-荧光检测-质谱（LC-FLD-MS）分析方法

研究人员以酶促或化学合成的9种标准品（Neu5Ac、Neu5Ac8S、Neu5Ac9S、Neu5Gc、Neu5Gc8S、Neu5Gc9S、Kdn、Kdn8S、Kdn9S）为对象，优化了色谱条件。所有DMB标记化合物在CAPCELL PAK ADME柱上实现完全分离，而常规C18柱无法有效分离硫酸化物种。负离子模式下，硫酸化物种的质谱响应显著优于正离子模式，可稳定检出10 pmol水平的标准品。通过MS/MS分析发现，C5取代基特异性碎片离子可用于区分三类骨架：Neu5Ac及其硫酸化衍生物产生m/z 286.08和100.04，Neu5Gc及其衍生物产生m/z 302.08和116.04，Kdn及其衍生物产生m/z 245.06。更重要的是，m/z 96.96（[HSO₄]^?）在8-O-硫酸化异构体中相对丰度更高，而m/z 138.97（[C₂H₃O₅S]^?）在9-O-硫酸化异构体中显著增强，二者比值差异达3～10倍，可作为区分C8/C9硫酸化位点的互补诊断离子。荧光检测对Neu5Ac8S的定量范围为1 fmol～10 pmol，负离子MRM-HR质谱检测限约50 fmol，灵敏度较正离子模式高约6倍。

### 2.2 钠加合物存在下CID和EAD碎裂模式的比较分析

为解决正离子模式下DMB核心碎片占主导、结构信息不足的问题，研究人员在电喷雾前加入醋酸钠形成钠加合物。结果显示，钠离子与唾液酸羟基的配位改变了电荷分布，使碎裂主要发生在唾液酸骨架上，分别产生Neu5Ac、Neu5Gc和Kdn的C5取代基特异性片段（m/z 244.08、260.07、203.05），避免了脱硫酸基和DMB优势碎裂。在CID谱中，所有9-O-硫酸化异构体均出现m/z 184.95（[C₂H₃Na₂O₅S]⁺）诊断离子，而8-O-硫酸化异构体无此离子。在EAD谱中，Neu5Ac8S和Neu5Gc8S分别产生m/z 430.12和446.12的特征碎片（对应失去一个硫酸基、一个钠离子和一个质子），而在9-O-硫酸化异构体中极弱或不存在。对于Kdn，CID中观察到一个较弱的Kdn8S特征碎片m/z 371.09，但EAD中相应碎片极弱。因此，负离子CID仍是最灵敏的检测方法，而钠加合正离子结合EAD能更清晰地实现C8/C9硫酸化位置异构体的判定。

### 2.3 海胆精子和卵子中SiaS物种的综合分析

为验证方法实用性，研究人员分析了海胆精子与卵子中的游离唾液酸。经阴离子交换分级，单电荷组分和双电荷组分分别收集。精子单电荷组分中检测到Neu5Ac（约为Neu5Gc的45倍），双电荷组分中检测到Neu5Ac8S和Neu5Gc8S，且MS/MS谱与标准品一致；未检测到9-O-硫酸化物种。卵子单电荷组分中仅检测到Neu5Gc，双电荷组分中检测到Neu5Gc8S（为主）和Neu5Gc9S（约70倍丰度差），提示卵子中存在特异性的9-O-硫酸基转移酶活性。同时，在卵子双电荷组分中发现一种此前未报道的结构Neu5GcS₁Ac₁，经UHPLC分离出三个可能的位置异构体。其中主要峰经碱性处理（6.5 N NH₃）后变为Neu5Gc8S，而中性水处理保持不变，证明其含有碱不稳定的O-乙酰基。高分辨MS/MS进一步确认了脱硫酸离子和含硫酸离子的质量位移，首次在LC-MS系统中通过碎片结构验证了硫酸化和乙酰化同时修饰的Neu5Gc存在。

讨论部分指出，新发现的Neu5GcS₁Ac₁可能对硫酸酯酶和酯酶具有更强抗性，从而增强其在体内的稳定性。哺乳动物中唾液酸乙酰化发生在CMP-唾液酸水平，而硫酸化发生在糖缀合物上，因此海胆中的硫酸基转移酶可能同时识别未修饰和乙酰化的唾液酸底物，这一推测为进一步寻找相关酶提供了方向。

研究结论可翻译如下：总之，研究人员建立了一种基于DMB衍生化的LC-FLD-MS分析策略，用于硫酸化唾液酸的定量和定性表征。负离子模式提供了高灵敏度的定量能力；而钠加合的正离子MS/MS，特别是与EAD结合，可通过特征碎片模式实现硫酸化位置异构体的结构区分。这些互补的分析方法为硫酸化唾液酸的灵敏检测和结构解析提供了稳健平台。该新方法已成功应用于生物样本，并在海胆卵中鉴定出此前未报道的唾液酸结构NeuGcS₁Ac₁。这些发现将有助于未来深入研究唾液酸修饰的生物学功能及唾液酸多样性。