可编程时空生物电神经导管：通过调控施万细胞ER–线粒体偶联抑制铁死亡促进周围神经再生

《Bioactive Materials》：A programmable spatiotemporal bioelectrical conduit promotes peripheral nerve regeneration by suppressing ferroptosis through modulation of ER–mitochondria coupling in Schwann cells

　　

周围神经缺损是常见的组织损伤类型，对功能重建构成重大挑战。施万细胞（Schwann cells）作为周围神经系统的主要胶质细胞，在神经修复中发挥核心作用，其髓鞘形成能力直接影响神经功能恢复的成效。然而，当前促进施万细胞髓鞘形成的策略往往受限于靶向特异性差、刺激短暂及调控机制不清等问题。近年来，线粒体相关膜（mitochondria-associated membranes，MAMs）作为内质网（endoplasmic reticulum，ER）与线粒体之间的结构和功能偶联位点日益受到关注。葡萄糖调节蛋白75（glucose-regulated protein 75，GRP75）作为关键的MAMs组分，通过连接ER驻留的肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP₃R1）与线粒体外膜电压依赖性阴离子通道（VDAC1），形成调控ER–线粒体钙转运的核心复合体。MAMs介导的钙转运不仅对维持线粒体膜电位和代谢稳态至关重要，还显著影响铁代谢途径，而铁死亡（ferroptosis）以Fe²⁺蓄积和过度脂质过氧化为特征，可能损害施万细胞髓鞘形成所需的膜与代谢稳态。因此，GRP75–IP₃R1–VDAC1钙信号轴是调控铁代谢、抑制铁死亡和促进施万细胞髓鞘形成的潜在治疗靶点。本研究开发了一种超声响应性多尺度各向异性电活性神经导管，外层由掺杂钛酸钡（BaTiO₃）纳米颗粒的甲基丙烯酰化明胶（GelMA）压电水凝胶构成，内层为定向排列的明胶/聚乳酸/石墨烯（gelatin/PLA/G）导电纳米纤维。该导管通过外层声–电响应性与内层定向导电的协同整合，建立了可编程时空生物电指令系统，实现了局部可控输出与空间引导能力。体内外实验结果表明，该导管产生的定向生物电刺激通过下调GRP75抑制了病理性的ER–线粒体异常偶联与过度MAMs形成，减少了ER向线粒体的异常Ca²⁺转移，从而恢复线粒体功能、缓解铁死亡，最终促进施万细胞髓鞘形成、轴突再生、神经血管网络重建和周围神经损伤后的功能恢复，其修复效果可与自体神经移植相媲美。

**论文解读**

**一、研究背景与问题提出**

周围神经缺损是临床上常见的组织损伤，常导致感觉和运动功能障碍，严重影响患者生活质量。尽管显微外科技术和组织工程策略不断进步，实现再生神经的有序重建和高质量功能恢复仍然是周围神经修复领域的核心难题。施万细胞（Schwann cells）作为周围神经系统的主要胶质细胞，在轴突再生和髓鞘再形成中发挥关键调控作用。髓鞘形成不仅为轴突提供机械保护，还促进轴突稳态并提升神经冲动传导效率，因此施万细胞能否在损伤后维持适当的迁移、定向排列和髓鞘形成能力，是决定周围神经修复结局的关键因素。

当前促进施万细胞髓鞘形成的策略主要包括外源性神经营养因子递送、电刺激、生物材料干预和转录因子调控等，但这些方法普遍存在靶向性差、刺激短暂和对底层调控机制认识不足等问题，限制了其临床转化。近年来，细胞内细胞器之间的动态相互作用，特别是线粒体相关膜（mitochondria-associated membranes，MAMs）——即内质网（endoplasmic reticulum，ER）与线粒体之间的结构与功能偶联位点——成为细胞功能调控研究的新焦点。葡萄糖调节蛋白75（glucose-regulated protein 75，GRP75）作为MAMs的关键组分，通过物理连接ER驻留的肌醇1,4,5-三磷酸受体（IP₃R1）和线粒体外膜电压依赖性阴离子通道（voltage-dependent anion channel 1，VDAC1），形成调控ER–线粒体钙转运的核心复合体。MAMs介导的钙转运不仅维持线粒体膜电位和代谢稳态，还显著影响铁代谢途径。铁死亡（ferroptosis）以Fe²⁺蓄积和过度脂质过氧化为特征，可能通过破坏膜完整性和细胞代谢稳态损害施万细胞的髓鞘形成功能，由此形成“钙信号紊乱–线粒体损伤–铁稳态失衡–髓鞘形成缺陷”的恶性循环。

此外，传统的电极依赖性电刺激虽然能在一定程度上改善周围神经损伤患者的功能预后，但其有效电场受电极放置、组织阻抗和个体解剖差异的强烈影响，缺乏局部信号生成、空间选择性递送、方向性引导和动态适应神经再生阶段性过程的能力。因此，如何将传统经验性电刺激升级为一种精准可控的时空生物电调控体系，成为亟待解决的关键科学问题。

**二、研究方法概述**

研究人员首先对来自GEO数据库（GSE177037）的施万细胞转录组数据进行了整合分析，涵盖正常状态及损伤后3、5、7天不同时间点，分析聚焦于线粒体膜电位、ER应激和铁死亡等相关通路。临床回顾性研究纳入178例周围神经病变患者（电刺激组57例，非电刺激组121例），评估常规电刺激的疗效。在材料构建方面，研究人员合成了甲基丙烯酰化明胶（GelMA），并掺杂钛酸钡（BaTiO₃）纳米颗粒制备压电水凝胶外层；内层采用静电纺丝技术制备定向排列的明胶/聚乳酸/石墨烯（gelatin/PLA/G）导电纳米纤维。通过紫外光交联将内外层整合为双层复合神经导管。体外实验采用大鼠施万细胞系RSC96和新生SD大鼠背根神经节（dorsal root ganglion，DRG）原代培养。体内实验采用SD大鼠坐骨神经缺损模型（10 mm缺损），设置对照组、模型组、自体移植组、定向电刺激（directional electrical stimulation，DES）组和非定向电刺激（undirected electrical stimulation，UES）组，术后12周进行综合评价。GRP75抑制实验通过腹腔注射GRP75抑制剂醉茄素A（withanone，WNN）进行。

**三、主要研究结果**

**（一）常规电刺激的临床疗效评估及对施万细胞ER应激和铁死亡的调控作用**

临床数据分析显示，电刺激组在感觉和运动功能障碍的改善方面优于非电刺激组，神经病变症状评分（neuropathy symptom score，NSS）和神经病变残疾评分（neuropathy disability score，NDS）的改善也更为显著。但中度至重度患者的改善比例组间无显著差异，表明常规电刺激疗效仍有限。转录组分析揭示损伤后施万细胞中存在以ER–线粒体稳态紊乱为中心的异常病理过程，伴随铁死亡激活和髓鞘形成程序失调。体内Western blot和免疫荧光染色进一步证实，周围神经损伤后施万细胞中ER应激相关蛋白CHOP和GRP75以及铁死亡相关蛋白ACSL4和FTH1的表达显著升高，GPX4显著降低。常规电刺激虽能在一定程度上缓解上述异常，但调控效果仍不充分。

**（二）多尺度各向异性复合神经导管的构建**

研究人员成功构建了超声响应性电活性神经导管。外层BaTiO₃-GelMA压电水凝胶的d₃₃压电系数随BaTiO₃含量增加而递增，流变学分析证实复合体系具有优异的粘弹性和机械稳定性。内层定向纤维膜具有高度一致的取向性，导电率显著高于非石墨烯对照组，电化学阻抗谱显示全频段阻抗更低。超声刺激下导管可产生随超声强度递增的电流和电压输出，在2.0 W/cm²下产生约0.21–0.25 V/cm的等效电场，处于神经调控电场的低强度范围内。长期稳定性评估表明，导管在体外PBS孵育12周后仍保持完整结构和可检测的声–电转换能力，体内植入12周后也维持了结构完整性和超声响应功能。

**（三）神经导管体外促进施万细胞迁移、髓鞘形成和DRG神经突生长**

生物相容性评价显示复合导管对施万细胞和DRG神经元均无显著细胞毒性。在1 W/cm²超声刺激下，定向纤维结构产生的定向电信号（DES）显著促进施万细胞的迁移数量和距离。DES组细胞沿纤维轴向呈细长形态，伸出双极伪足，形成类似“Büngner带”的结构，细胞取向角主要集中在0°–10°范围，伪足长度显著大于非定向电信号（UES）组。Western blot结果表明DES组髓鞘相关蛋白MBP、MPZ和S100β的表达显著上调。DES组施万细胞条件培养基中神经营养因子BDNF、GDNF、IGF-1和FGF2的分泌显著增加，并能显著促进DRG神经元的神经突延伸和分支。

**（四）定向电刺激通过抑制施万细胞铁死亡促进周围神经修复**

RNA-seq分析显示DES干预导致1077个基因差异表达（503个上调，574个下调），差异基因显著富集于铁死亡、未折叠蛋白反应和线粒体氧化磷酸化等通路。Western blot证实DES处理显著增加GPX4表达，降低FTH1、ACSL4和脂质过氧化终产物4-HNE的水平，并有效减少细胞内Fe²⁺蓄积。铁死亡诱导剂erastin可部分逆转上述保护效应，并削弱DES对髓鞘蛋白MPZ和MBP的恢复作用。铁死亡抑制剂Ferrostatin-1（Fer-1）作为阳性对照，表现出与DES一致的铁死亡抑制趋势，包括降低Fe²⁺和丙二醛（MDA）水平、恢复GPX4表达及部分挽救MPZ和MBP的表达。此外，DES还影响了铁蛋白自噬（ferritinophagy）相关蛋白LC3-II和p62的表达。

**（五）定向电刺激调控施万细胞ER–线粒体相互作用**

DES处理显著下调GRP75和CHOP的表达，改善LPS诱导的ER扩张和线粒体肿胀。透射电镜和共聚焦分析均证实DES可减弱LPS诱导的ER–线粒体接触增加，减少异常MAMs形成。DES还显著降低线粒体ROS积累，恢复线粒体膜电位，逆转氧化磷酸化相关基因（SDHB、COX5B、NDUFB8）的下调，并增加电子传递链复合体II和IV的蛋白表达。代谢层面，DES显著提高ATP产量，减少乳酸积累，提示其促进代谢模式从糖酵解向线粒体氧化代谢转变。ER应激诱导剂毒胡萝卜素（thapsigargin）可重新增加ER–线粒体接触并部分消除DES的线粒体保护效应，印证了ER–线粒体偶联正常化是DES保护线粒体功能的关键中间环节。

**（六）GRP75介导DES对ER–线粒体相互作用、Ca²⁺稳态和铁死亡的调控效应**

LPS处理显著增加IP₃R1、GRP75和VDAC1的蛋白表达，而DES处理显著降低三者水平。GRP75过表达实验表明，GRP75过表达可逆转DES对ER–线粒体接触的减弱效应，并削弱DES对线粒体Ca²⁺超载的抑制作用。原位邻近连接技术（PLA）进一步证实DES减少了IP₃R1–GRP75和GRP75–VDAC1蛋白对之间的近距相互作用，GRP75过表达可逆转这一效应。下游表型方面，GRP75过表达减弱了DES对ATP产生的恢复和对线粒体ROS的清除作用，并削弱了DES对铁死亡相关蛋白GPX4、ACSL4和4-HNE的调控，以及DES对总ROS和脂质过氧化的抑制。

**（七）神经导管在神经再生中的评价**

体内植入12周后，导管与周围组织整合良好，被富含血管的筋膜覆盖，无明显瘢痕组织。DES组的复合肌肉动作电位（compound muscle action potential，CMAP）振幅显著大于模型组和UES组，与自体移植组相当。HE染色显示DES组细胞排列密集、细胞外基质（extracellular matrix，ECM）有序。透射电镜显示DES组和自体移植组均出现明显的成簇有髓纤维，而UES组仅有散在薄层髓鞘结构。DES组g-ratio（轴突直径/纤维直径）为0.68 ± 0.10，接近自体移植组（0.66 ± 0.09）和正常神经组织（0.60 ± 0.08）。免疫荧光染色显示DES组MBP、PGP9.5、NF200和S100β阳性信号密度显著增高，再生神经纤维沿导管轴向呈更明显的定向排列。DES组毛细血管密度（vWF和α-SMA染色）也显著高于UES组。体内Western blot和qRT-PCR证实DES可逆转损伤诱导的GRP75和CHOP升高以及氧化磷酸化基因的下调。

**（八）神经健康与功能评估**

DES组腓肠肌萎缩程度显著轻于UES组，肌肉湿重比与自体移植组相当。Masson三色染色显示DES组肌纤维直径大于UES组。多普勒超声和激光散斑对比成像表明DES组坐骨神经区域血流速度和灌注面积明显改善。足趾伸展实验和步态分析显示，DES组大鼠足底伸展接近正常，坐骨神经功能指数（sciatic functional index，SFI）恢复约68.98%，显著优于UES组的32.72%。

**（九）醉茄素A增强导管对坐骨神经损伤的修复效果**

GRP75抑制剂WNN可进一步降低GRP75蛋白表达，DES+WNN组大鼠实现完全足趾伸展和稳定负重，SFI显著高于单独DES组，MEP振幅显著增大，腓肠肌湿重比进一步增加。免疫荧光显示DES+WNN组NF200、S100和GPX4表达进一步增强，GRP75抑制更为显著。

**四、讨论总结与研究结论**

本研究的核心创新在于将传统的经验性电刺激升级为一种可编程时空生物电指令系统。该系统的关键在于：超声触发决定信号生成的时机，超声强度调控输出幅度，定向导电纤维引导电信号沿神经再生近端–远端轴定向传输。因此，DES的治疗逻辑不在于简单增强刺激强度，而在于精确控制生物电信号在再生微环境中传递的位置、时机和方向。

研究表明，周围神经损伤后施万细胞呈现显著的ER–线粒体应激和铁死亡异常激活，构成限制神经再生的重要病理基础。多尺度各向异性神经导管产生的定向生物电刺激通过下调GRP75抑制异常MAMs形成，恢复线粒体氧化磷酸化和能量代谢，最终抑制施万细胞铁死亡，从而促进髓鞘形成、轴突再生、神经血管网络重建和靶肌肉功能恢复，修复效果可接近自体神经移植水平。本研究为长段周围神经缺损的治疗提供了一种具有显著转化潜力的工程化治疗策略。同时，研究也指出GRP75介导的异常ER–线粒体偶联与Ca²⁺稳态、铁蛋白自噬及更广泛代谢重编程之间的关系仍需深入研究，DES对铁死亡的调控是否具有细胞类型特异性尚待阐明，该体系在大型动物模型中的长期稳定性、功能适应性和临床可操作性也需进一步验证。