基于内源性OPTIR成像与光谱技术的活细胞杆状病毒感染无标记监测

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Intrinsic OPTIR imaging and spectroscopy enable label-free monitoring of viral infection in living cells

　　

在不引入需要遗传可及性且可能干扰所研究过程的荧光标记的情况下，解析单个活细胞内与病毒感染进展相关的生化特征，仍然是传统光学方法面临的一项挑战。光学光热红外（Optical Photothermal Infrared, OPTIR）光谱技术通过在活细胞中提供具有分子键特异性的无标记振动对比度来解决这一问题，同时结合了亚微米空间分辨率与水性介质中水背景的强抑制能力。本研究将OPTIR离散波数成像和点光谱技术应用于追踪不携带荧光报告子的活体草地贪夜蛾（Spodoptera frugiperda, Sf）9细胞中的杆状病毒（baculovirus）感染。细胞在CaF₂夹层配置中于感染后3、6、12和24小时（hours post-infection, hpi）进行测量。在酰胺II蛋白带（1545 cm^?1）和核酸带（1086 cm^?1）处的成像在每个时间点提供了感染与未感染细胞之间的空间区分，平衡准确率（balanced accuracy）达到0.90；而点光谱将成对平衡准确率提高至0.94，并确认了图像对比的生化基础。跨时间点的多类分离总体准确率达到0.71。单细胞异质性通过均匀流形近似与投影（Uniform Manifold Approximation and Projection, UMAP）进行量化，跨重复可重复性作为内部验证。这些发现表明，OPTIR能够仅利用内源性生化特征实现活细胞中病毒感染的无标记监测，为基因编码荧光报告子提供了一种实用的替代方案。

**论文解读**

**一、研究背景与问题提出**

在活细胞中实时解析动态生物学过程——从胞内信号传导到宿主-病原体相互作用——是理解生物学功能的核心任务，然而其时空尺度对分析方法提出了持续挑战。荧光显微镜极大地推动了这一领域，使亚细胞组织和分子行为的直接可视化达到了前所未有的时空细节水平。在病毒学研究中，荧光方法已能够捕获感染过程中的单个病毒核糖核蛋白以及单个病毒颗粒与细胞表面的初始接触。然而，尽管荧光显微镜已深刻改变了感染生物学研究，大多数实施方案依赖基因操作或外源性标记，两者都可能影响细胞生理状态。基于内源性代谢辅因子（如NAD(P)H和FAD）的荧光寿命成像显微镜（Fluorescence Lifetime Imaging Microscopy, FLIM）是一个值得注意的例外，已被用于无标记探测病毒、衣原体和细菌感染中的宿主-病原体代谢。然而，基于自发荧光的FLIM主要局限于少数内源性荧光代谢物，且主要反映氧化还原和代谢状态，而非细胞更广泛的分子组成。因此，一种能够同时监测蛋白质、核酸和脂质在其天然生物状态下的无标记探针，将显著拓展活细胞感染研究的范围。

振动光谱通过无标记方式探测细胞的内源性分子组成，提供了这一能力。其中，傅里叶变换红外显微光谱（μFTIR）已被广泛应用于单细胞化学成像，例如解析疟原虫感染红细胞的特异性阶段特征、实现感染细胞的自动化区分以及检测支原体污染。然而，这些方法通常需要干燥或固定样本，限制了其在病毒感染等动态活细胞过程中的应用。衰减全反射（Attenuated Total Reflection, ATR）配置部分解决了这一限制，而同步辐射源进一步提升了单细胞成像灵敏度，但中红外波段水的强吸收以及这些方法的样本几何限制，仍然制约其在生理条件下常规活细胞研究中的应用。光学光热红外（OPTIR）光谱通过间接测量原理克服了这些限制：脉冲可调谐量子级联激光器（Quantum Cascade Laser, QCL）在选定中红外波长处激发分子振动，诱导局部加热和折射率瞬态变化，由共线可见光探针光束测量。由于可见光探针决定了空间分辨率，因此实现了亚微米级分辨率，且折射率对比度抑制了原本占主导地位的水吸收，允许在水性环境中获取活细胞光谱。

在此背景下，杆状病毒表达载体系统（Baculovirus Expression Vector System, BEVS）在重组蛋白生产、生物农药开发和基因治疗载体工程中具有重要意义，但监测其感染进程通常需要共表达荧光报告子或依赖终点检测（如空斑滴定）。更具挑战性的是，不携带报告子的未修饰感染无法通过专用荧光通道获取进程信息，必须从细胞的内源性分子组成中推断。因此，开发一种能够在单个活细胞水平上、无需任何标记即可追踪病毒感染全过程的方法，具有重要的学术价值和应用前景。

**二、研究概述与意义**

研究人员将OPTIR成像和光谱技术应用于追踪活体Sf9细胞（一种永生化昆虫细胞系）中杆状病毒感染在3、6、12和24 hpi四个时间点的时间进程。细胞在CaF₂夹层配置中保持活性和稳定水合状态。研究人员从单个活细胞中采集OPTIR点光谱并进行预处理分析，获取蛋白质（酰胺II，1545 cm^?1）和核酸（ν(PO₂^?)，1086 cm^?1）波段的离散波数成像，并从中提取每个细胞的蛋白质和核酸总强度以捕获生物分子组成的变化。通过主成分分析-线性判别分析（Principal Component Analysis-Linear Discriminant Analysis, PCA-LDA）区分感染与未感染细胞，并利用UMAP捕捉单细胞异质性。

研究发现，OPTIR能够仅利用内源性生化特征实现活细胞中病毒感染的无标记监测，成对分类平衡准确率最高达0.94，四类时间点多类分离总体准确率达0.71，且LD1轴将时间点按正确的时间顺序排列。该研究表明OPTIR为基因编码荧光报告子提供了一种实用的替代方案，可扩展至哺乳动物病毒感染、宿主-病原体相互作用研究、高内涵表型筛选以及抗病毒药物反应的无标记监测，将活细胞成像拓展至荧光方法此前难以触及的领域。

**三、关键技术方法**

本研究采用mIRage-LS显微镜系统（Photothermal Spectroscopy Corporation），配备785 nm探针激光和四模块脉冲QCL泵浦源（MIRcat QT^?），覆盖973–1855、1980–2390和2695–2999 cm^?1波段。Sf9细胞（来源：Leibniz Institute DSMG，德国布伦瑞克）在Insect-XPRESS^?培养基中培养，以感染复数（Multiplicity of Infection, MOI）为2的重组杆状病毒感染，在3、6、12和24 hpi取样。细胞通过CaF₂夹层配置固定在水性介质中，底部CaF₂玻片涂覆多聚-D-赖氨酸（Poly-D-Lysine），密封配置在连续数小时测量中保持样本水合。光谱以2 cm^?1间隔在高信噪比模式下采集（扫描速度200 cm^?1/s，光谱分辨率6.6 cm^?1），每张光谱为四次扫描的平均值；离散波数成像在500×500 μm²视场内以1 μm/点步长和1000 μm/s扫描速度采集。所有实验设两个生物学重复。数据分析采用扩展乘法散射校正（Extended Multiplicative Scatter Correction, EMSC）和Savitzky–Golay滤波进行预处理，通过Hotelling T²统计量和Q残差进行异常值检测，以嵌套交叉验证的PCA-LDA进行分类，并通过UMAP量化单细胞异质性。成像分析使用Cellpose在1545 cm^?1通道上进行细胞分割。

**四、主要研究结果**

**（一）活体Sf9细胞在水性缓冲液中的OPTIR光谱**

研究人员获取了阴性对照（Negative Control, NC）和感染（Infected, INF）Sf9细胞在3、6、12和24 hpi的平均OPTIR光谱。水相缓冲液扣除前，光谱被水在1641 cm^?1处的宽O–H弯曲振动主导，该峰与酰胺I带（约1660 cm^?1）重叠，但指纹区1547、1461、1401和1087 cm^?1处以及高波数区2853、2927和2961 cm^?1处仍可见一致的IR谱带。酰胺II带（1547 cm^?1）归属于N–H面内弯曲和C–N伸缩振动；1461和1401 cm^?1分别归属于蛋白质CH₂变形和COO^?对称伸缩；1087 cm^?1归属于RNA/DNA核酸中PO₂^?的对称伸缩模式。缓冲液扣除后，1241 cm^?1处的酰胺III/PO₂^?反称伸缩带和高波数区CH₂和CH₃伸缩模式得以清晰分辨。酰胺I区（1600–1690 cm^?1）因残余水贡献而无法确证，这解释了后续PCA-LDA分析将光谱截断至1600 cm^?1的原因。

**（二）活体Sf9细胞的无标记红外成像**

在1545 cm^?1（酰胺II）和1086 cm^?1（对称磷酸根）两个离散波数处获取红外图像，分别代表细胞蛋白质和核酸的分布。将每个细胞在1545 cm^?1和1086 cm^?1处的平均强度按每个重复针对NC群体进行标准化后投影到单一线性判别轴（LD1）上。结果显示，在3 hpi时NC与INF即已出现可区分的LD1位移（平衡准确率0.66），6 hpi时平衡准确率提升至0.80，12 hpi时达0.89，24 hpi时达0.90。两个成像频率从蛋白质（酰胺II）和核酸（磷酸根伸缩）捕获互补的生化信息，LDA在每个时间点（包括最早的3 hpi）均实现了细胞群体的分离，表明微妙的生化差异在此阶段即已存在，且可直接从空间分辨红外成像中加以区分。

**（三）感染Sf9细胞的成对分类**

基于OPTIR光谱指纹，PCA-LDA对NC和INF细胞在3、6、12和24 hpi的成对分类平衡准确率分别达到0.88、0.89、0.94和0.92，NC与INF中位数之间的差距随感染进展而扩大。LD1系数分析揭示了一个蛋白质-脂质光谱特征：在3和6 hpi，酰胺II（1545 cm^?1）、酰胺III（1241 cm^?1）、1395 cm^?1（COO^?）以及CH₂伸缩振动（2855和2923 cm^?1）位于NC侧，对称磷酸根ν_s(PO₂^?)（约1085 cm^?1）位于INF侧。在12和24 hpi，该模式发生反转：同一组蛋白质谱带与ν_s(PO₂^?)一同移至INF侧，而CH₂伸缩振动贡献于NC侧。1241 cm^?1特征被归属为酰胺III而非反称磷酸根ν_as(PO₂^?)，因为它与酰胺II符号一致，而非与ν_s(PO₂^?)呈反相关。这种蛋白质-脂质光谱特征在感染早期（3–6 hpi）和晚期（12–24 hpi）之间发生极性反转，与杆状病毒感染Sf9细胞中已报道的整体蛋白质组变化方向一致。

**（四）感染Sf9细胞的多类分析**

为评估OPTIR区分不同感染时间点的灵敏度，研究人员对四个INF组（不含NC参考）进行了多类LDA分析。LD1–LD3得分的二维和三维投影显示出清晰的时间结构：24 hpi沿LD1负方向与其他三个时间点明显分离，而3、6和12 hpi在LD空间中占据相邻体积并存在大量重叠，这与生物学上相邻时间点共享大量生化内容的连续感染状态预期一致。LD系数主要由指纹区驱动，涉及酰胺III带（约1241 cm^?1）、对称磷酸根ν_s(PO₂^?)（约1083 cm^?1）以及酰胺II/CH₂–CH₃区域（约1461–1543 cm^?1）。四类模型的总体平衡准确率为0.71，远超0.25的随机水平。LD1将四个类别按正确的时间顺序排列，表明变异的主要轴追踪的是感染进展而非随机类别结构。

**（五）杆状病毒感染的单细胞间变异**

研究人员利用UMAP对每个生物学重复（R1和R2）的单细胞光谱进行嵌入分析，并通过PC空间中每个细胞到其所属时间点质心的欧几里得距离量化细胞间变异。R1中3、6、12和24 hpi的细胞-质心距离（中位数±SD）分别为0.37±0.20、0.44±0.18、0.27±0.25和0.22±0.12；R2中分别为0.25±0.14、0.43±0.27、0.33±0.24和0.37±0.18。两个重复均显示细胞间变异从3到6 hpi增大，随后向感染后期减小，这与细胞以不同速率经历感染进程、在感染中期经过最大异质性窗口后趋向晚期状态的模式一致。R2在24 hpi时感染群体活力降至84%，而R1全程保持≥95%，这解释了R2晚期阶段离散度较宽的原因。

**五、讨论总结与研究结论**

该研究的主要发现是从Sf9细胞的内源性OPTIR特征出发，实现了感染与未感染细胞的稳健区分，成对平衡准确率为0.88至0.94，且四个感染时间点沿LD1呈现清晰的时间排序。UMAP和细胞-质心分析在单细胞水平提供了互补视角，表明四类模型0.71的准确率反映的是真实的生物学异质性而非分类器局限：单个细胞以不同步方式经历感染进程，因此单个名义时间点包含处于多种生化状态的细胞，这种分布在6至12 hpi最为显著，此时成对分离也最弱。成像和点光谱两种模式互补——成像在少数预选波数处快速筛选大量细胞群体，而光谱以较低通量解析每个细胞的完整指纹——支持先以成像识别目标细胞、再以光谱进行深度探测的工作流程。该生化特征并非杆状病毒独有，因为蛋白质、核酸和脂质含量的变化伴随病毒复制普遍发生，类似变化已在细菌和寄生虫感染中报道，因此该方法可推广至遗传修饰不可行的系统（如原代细胞、临床分离株和无报告子构建的新发病原体）。

研究结论（翻译）：OPTIR成像和光谱以无标记方式检测了Sf9细胞中杆状病毒感染引起的生化变化。在酰胺II（1545 cm^?1）和对称磷酸根（1086 cm^?1）处的离散频率OPTIR成像结合LDA，在所有时间点成功分类感染与未感染细胞群体，24 hpi时平衡准确率达0.90；若增加1241 cm^?1（酰胺III）处的离散频率图像，有望进一步改善3和6 hpi的LDA分类性能。单细胞OPTIR光谱结合LDA也以最高0.94的成对平衡准确率分类对照和感染细胞，仅基于感染光谱训练的LDA模型达到0.71的中等分类准确率。跨时间点的LD1系数揭示了一个蛋白质-脂质特征，该特征在感染早期和晚期之间发生极性反转，与杆状病毒感染Sf9细胞中报道的整体蛋白质组变化一致。两种模式互补：点光谱以牺牲通量和细胞数量为代价提供完整的生化指纹，而成像则能够以有限的生化特异性高通量筛选大量细胞群体，二者的选择应依据实验设计、时间限制和样本活力。在群体水平分析之外，UMAP结合欧几里得距离度量揭示了显著的细胞间变异，该变异在6和12 hpi时最大，与单个细胞以不同速率经历感染进程一致。总体而言，本研究确立了OPTIR作为一种通过内源性生化特征监测活细胞中病毒感染的强大无标记平台，从而为基于荧光的报告系统提供了一种有吸引力的替代方案。最后，将OPTIR光谱和成像拓展至更复杂的生物样本（如原代细胞或临床标本），将拓宽该方法的适用范围，并推动其在更具生理相关性背景下研究感染生物学的潜力。