维生素D结合蛋白（DBP）测量方法的研究进展：从抗体免疫分析到质谱定量

《ANALYTICAL AND BIOANALYTICAL CHEMISTRY》：Advances in the measurement of vitamin D binding protein

　　

摘要专业翻译 维生素D结合蛋白（vitamin D binding protein，DBP）是一种多态性蛋白，以其转运维生素D代谢物的功能而著称。DBP在机体对组织损伤和炎症的应答中还发挥着若干其他重要作用。DBP的测量是理解其与维生素D状态关系的基础，也是阐明DBP浓度与多种健康结局之间潜在联系的关键。早期DBP研究主要采用基于抗体的技术进行定量，而近十年来已有基于质谱（mass spectrometry，MS）的方法报道。本综述将概述DBP研究中使用的不同方法学及参考物质赋值的策略，阐述其优势与局限性，并展望未来发展趋势。

论文主体内容总结

引言

维生素D结合蛋白（DBP），最初被称为组特异性成分（group-specific component，Gc），是维生素D及其代谢物的主要血浆转运蛋白。维生素D对骨骼健康至关重要，其缺乏可导致儿童和成人骨骼相关疾病。维生素D（无论是D₂还是D₃）在肝脏中经羟基化生成相应的代谢物25-羟基维生素D₂[25(OH)D₂]和25-羟基维生素D₃[25(OH)D₃]，这些代谢物随后可发生进一步的羟基化反应。DBP在肝脏中合成，对维生素D代谢物具有高结合亲和力。循环中85%至90%的25(OH)D与DBP结合，其余12%至15%与白蛋白松散结合。25(OH)D这一术语通常指25(OH)D₂和25(OH)D₃浓度之和。DBP是血浆中含量最丰富的蛋白质之一，其浓度通常远超其维生素D代谢物配体的浓度。多数文献报道人血清中DBP浓度在200 mg/L至500 mg/L之间。妊娠与DBP浓度升高相关，而肝脏和肾脏疾病可导致DBP水平降低。除转运维生素D代谢物外，DBP还具有若干其他生物学功能，目前仍是研究热点。

人DBP分子量约为58 kDa，由458个氨基酸组成，与白蛋白和甲胎蛋白具有显著的序列同源性。DBP最重要的早期发现之一是其高度多态性。目前已鉴定出100多种DBP变异体，其中三种最常见的亚型（Gc1f、Gc1s和Gc2）由两个单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphisms，SNPs）rs7041和rs4588的不同组合产生。氨基酸序列变异还导致三种主要变异体之间糖基化模式的差异，这可通过其电泳迁移率的变化观察到。关于DBP各遗传变异体对维生素D代谢物结合亲和力是否存在差异，不同研究结果尚不一致。

尽管DBP自20世纪50年代末就已被发现，但过去二十年间，聚焦于阐明DBP在维生素D状态和整体健康中作用的研究显著增加。DBP的测量已成为许多此类研究的重要环节。

为什么测量DBP？

维生素D状态通常通过测量血清或血浆中的总25(OH)D来评估。25(OH)D的测量通常涉及将代谢物从DBP中释放的步骤，可通过提取或置换实现。多项研究表明，免疫分析中25(OH)D从DBP的不完全释放可能导致25(OH)D浓度被低估，尤其是在DBP浓度较高的个体中。Muller Kobold等人报道，与标准化液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）方法相比，孕妇中升高的DBP浓度与某商业免疫分析25(OH)D结果的负偏倚相关，当样品经胃蛋白酶预处理以确保25(OH)D完全释放后，该偏倚基本得到纠正。Heijboer等人将多种自动化25(OH)D免疫分析方法与同位素稀释LC-MS/MS方法进行比较，发现某些自动化方法的不准确性似乎与DBP浓度相关。近期一项针对NIST标准参考物质（SRMs）的可交换性研究指出，SRM 1949冻干人孕期血清的一个或多个水平存在缺乏可交换性或可交换性结果不确定的问题。该四级参考物质由非妊娠女性及妊娠各期女性的混合血清制备，已赋予DBP浓度认定值。尽管该研究并非聚焦于分析方法性能，但SRM 1949中较高DBP浓度下多数配体结合分析缺乏可交换性的观察结果表明，DBP测量可能对理解25(OH)D分析在特定人群中的性能具有重要意义。

25(OH)D测量仍是最广泛使用的维生素D状态评估工具，尽管该代谢物需在肾脏中进一步羟基化才能产生具有生物活性的代谢物1,25(OH)₂D。研究人员一直在探索可能揭示维生素D暴露与癌症、心血管疾病和糖尿病等疾病之间潜在联系的额外生物标志物。由于类固醇激素（如维生素D）的生物活性被认为与其未结合形式而非激素总量相关（游离激素假说），许多研究者提出"游离"或"生物可利用"25(OH)D浓度可能是比总25(OH)D更好的维生素D状态指标。仅有很小比例（<1%）的25(OH)D以"游离"状态存在，即未与任何蛋白质结合，而"生物可利用"25(OH)D这一术语用于指任何未与DBP结合的25(OH)D。游离25(OH)D的直接测量因其极低浓度（pg/mL）以及扩散和透析步骤的需要而较为困难。目前已有商业化的游离25(OH)D两步免疫分析方法，并已用于评估若干NIST SRMs中的游离25(OH)D浓度。另一种方法是利用包含DBP浓度、白蛋白浓度以及25(OH)D结合亲和常数的方程来计算生物可利用25(OH)D。因此，DBP浓度的准确测量对于研究游离或生物可利用25(OH)D浓度与各种健康结局之间关联的研究可能具有重要意义。

DBP测量还被用于调查个体存在严重维生素D缺乏但对补充治疗无应答的情况。Henderson等人报道了一名强直性脊柱炎患者25(OH)D水平检测不到，该患者对任何形式的维生素D补充均无应答，其DBP水平也低于其质谱方法的检测限（<3 μg/mL）。遗传分析揭示该患者存在GC基因的纯合缺失，导致DBP缺如。Banerjee描述了一名尽管强化补充但25(OH)D浓度仍极低的患者，其DBP经质谱检测无法检出（<10 μg/mL），进一步调查发现导致DBP缺失的功能丧失型变异。在这些病例中，DBP测量有助于阐明看似治疗抵抗性缺乏的潜在原因。

除转运维生素D代谢物这一公认作用外，DBP在调节机体对组织损伤的应答中也发挥重要作用。DBP结合组织损伤后释放的肌动蛋白单体，防止其聚合成可导致器官功能障碍的纤维。这一过程消耗了可用的DBP储备，DBP浓度降低已被提出作为严重创伤和脓毒症的指标。研究还提示DBP浓度与糖尿病、神经精神疾病和多发性硬化之间存在潜在联系，进一步证明了DBP在理解多种医学状况中的重要性。

基于抗体的DBP检测方法

20世纪70年代，多个研究组报道了作为DBP浓度与各种健康状况关系研究一部分的DBP测量。这些方法通常采用某种形式的抗体-抗原结合来实现定量。Bouillon等人使用放射免疫扩散法测量人血清中的DBP，并注意到女性妊娠期间DBP浓度升高。该方法使用从兔获得的抗DBP抗血清，通过抗体-抗原相互作用形成的环形沉淀直径来定量DBP。Haddad和Walgate开发了DBP放射免疫分析法，未观察到维生素D缺乏与维生素D补充个体之间DBP浓度存在显著差异。该方法中，人血清DBP对¹²⁵I-DBP的置换可用于检测极小体积（<10 nL）血清样品中的DBP。Imawari和Goodman同样开发了用于血清DBP测量的放射免疫扩散和放射免疫分析方法，并注意到肝硬化患者的DBP浓度较正常受试者降低。

20世纪80年代，Walsh和Haddad利用DBP在电场中的迁移开发了"火箭"电泳定量方法。将抗DBP抗血清掺入琼脂糖凝胶中，火箭状沉淀模式的高度可与血清中DBP浓度相关联。十年后，Haughton和Mason报道了自动化免疫比浊法测定DBP。该方法中，抗体-抗原复合物引起的光散射与DBP浓度呈线性相关。他们强调，与放射免疫分析或放射免疫扩散技术相比，自动化方法在精密度方面有所改善。2004年，Jorgensen等人报道了一种用于血清和血浆中DBP测量的抑制ELISA方法。该方法使用小鼠单克隆抗体，与此前使用多克隆抗体的方法不同。他们注意到同一供体的血清和血浆中DBP浓度相似，且DBP水平似乎不受冻融循环的影响。该研究中，男性平均DBP浓度略低于女性，且女性妊娠期间DBP浓度升高。

基于抗体的方法的潜在局限性

如前所述，DBP浓度可用于估算生物可利用25(OH)D水平，目前已有商业化的DBP免疫分析方法。在使用这些方法时，DBP的多态性有时被忽视。Powe等人报道，美国黑人平均循环DBP和25(OH)D浓度均低于美国白人。这一观察使作者得出结论，尽管白人25(OH)D浓度通常较高，但两组具有等效的生物可利用25(OH)D水平。然而，对结果的进一步审查提示，所用DBP分析中的单克隆抗体可能对三种主要表型（Gc1f、Gc1s、Gc2）不具有等效结合，这可能导致了测量偏倚。后续使用多克隆抗体的研究未发现黑人与白人之间DBP浓度存在显著差异。

基于抗体的DBP分析还可能受到肌动蛋白结合的潜在干扰，肌动蛋白结合引起DBP构象变化，可能阻断抗体识别的某些表位。Hong等人使用不受过量肌动蛋白存在影响的抗体对开发了DBP免疫分析方法，并确认脓毒症患者的平均DBP浓度低于健康个体。

基于质谱的DBP检测方法

通过"自下而上"方法进行蛋白质定量是质谱方法中成熟的技术。目标蛋白通过胰蛋白酶或其他酶消化为其组成肽段，一个或多个肽段被定量作为蛋白质浓度的替代指标。Henderson等人开发了用于DBP测量的LC-MS/MS方法，并将其结果与常用的单克隆免疫分析方法进行比较。由于DBP是血清中含量较丰富的蛋白质之一，该LC-MS/MS方法无需亲和富集技术。作者使用三种常见DBP蛋白形式共有的两个肽段（VLEPTLK和ELPEHTVK）进行定量，并使用第三个肽段THLPEVFLSK进行质量控制。使用这三个肽段的目的是确保结果不会因特定DBP亚型的存在或缺失而产生偏倚。他们报道，当使用LC-MS/MS方法测量时，黑人和白人个体的DBP浓度相似；然而，单克隆免疫分析结果提示这两组之间DBP浓度存在显著差异，与其他研究者的观察一致。作者进一步提出，DBP的多态性特征和潜在糖基化位点可能影响针对多态性附近区域的免疫分析性能。

Kilpatrick和Phinney描述了类似的LC-MS/MS方法，并用于检测含有全部三种主要DBP亚型的混合血浆参考物质（NIST SRM 1950人血浆代谢物）。评估了主要DBP蛋白形式共有的六个肽段用于定量，并根据分析重现性选择了其中三个。同位素标记肽作为内标进行定量。该方法进一步应用于SRM 1950和SRM 1949冻干人孕期血清中DBP浓度的赋值，使它们成为首批具有DBP认定值的参考物质。

Ko等人报道了一种多重LC-MS/MS方法，用于同时定量血清中的DBP、白蛋白、25(OH)D和24,25(OH)₂D₃。该方法使用豚鼠血清溶液作为DBP和白蛋白的内标，使用三个肽段（LPDATPK、LPDATPTELAK和LPEATPTELAK）来鉴定存在的DBP亚型，另使用一个对所有三种蛋白形式共有的肽段VLEPTLK进行DBP定量。

质谱方法的一个可能不立即显现的优势是，如果方法中包含蛋白形式特异性肽段，则无需基因检测即可鉴定个体的单倍型。Henderson等人将质谱鉴定的单倍型（Gc1s、Gc1f和Gc2）与社区动脉粥样硬化风险（ARIC）研究参与者的基因型数据进行比较，LC-MS/MS方法的单倍型鉴定准确率>98%。同时了解DBP浓度和表型可能有助于探索25(OH)D浓度以外的维生素D状态指标。

基于质谱的方法的潜在局限性

尽管DBP质谱方法不受基于抗体的方法中潜在偏倚来源的影响，但它们可能受到其他来源的实验误差影响，尤其是当特定蛋白形式事先未知时。各蛋白形式之间消化动力学的差异可能导致目标肽段释放速率不同，从而在定量中产生偏倚。Kilpatrick等人通过将纯合供体的DBP掺入混合人血清制备外部校准品，无论向混合血清中掺入哪种蛋白形式（Gc1s、Gc1f和Gc2），均获得相似的定量结果。这些结果以及两个实验室使用不同方法和仪器对同一样品进行LC-MS/MS测量的比较数据表明，通过仔细选择肽段和优化方法，可以实现DBP的可重现定量。

单个DBP蛋白形式的定量仍然是一个挑战，因为亚型特异性肽段上存在潜在糖基化位点。同位素标记糖肽尚未常规合成用于定量，且同一肽段的糖基化和非糖基化形式可能同时存在于同一样品中。糖基化肽段的电离效率通常低于其非糖基化对应物，这给LC-MS/MS定量带来测量偏倚的风险。

未来趋势

DBP测量将继续成为理解维生素D在健康和疾病中复杂作用的重要组成部分。研究表明DBP浓度与某些自身免疫性疾病风险之间存在潜在联系，进一步研究可能带来优化维生素D状态的新策略。不受Gc表型影响的DBP免疫分析可能是未来需要高通量测量时优先选择的方法。然而，越来越多的研究关注DBP表型与疾病风险或结局之间的潜在关联。例如，近期一项关于生殖结局的研究提示，某种DBP变异体可能与活产几率增加相关。Rozmus等人在一篇综述中也强调了某些DBP变异体与癌症风险之间的潜在关联。未来这些领域的研究可能需要将免疫分析与基因分型信息相结合，或使用能够鉴定蛋白形式的LC-MS/MS方法，以同时获取DBP浓度和表型信息。